低聚果糖分析方法及其检测标准的探讨

低聚果糖分析方法及其检测标准的探讨

低聚果糖（fructo-oligosacchrides，FOS）又名蔗果低聚糖、寡果糖或蔗果三糖族低聚糖。近年研究发现，低聚果糖具有双向调节人体肠道微生态的功能，既能增加肠道内双歧杆菌的数量，又能同时抑制其他有害菌的生长[1-4]。而且低聚果糖很难被人体消化吸收，是一种低能量的糖，不会引起肥胖[5]。因此，低聚果糖成为近年来功能食品的研发热点之一。目前检测低聚果糖含量的方法主要有纸色谱分离法、气相色谱法和高效液相色谱法[6]，其中，高效液相色谱法最为简便和准确。但该法在实际使用中，包括国标规定的方法中，仍存在某些值得商榷的定性定量问题。本文拟根据我们的研究结果与经验就这些问题进行初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乙腈（色谱纯），美国天地公司；果糖、葡萄糖、蔗糖，纯度≥98%，美国Sigma公司；低聚果糖样品、超纯水实验室制备。

FA1104电子天平，上海精天电子仪器厂；Waters 600 高效液相色谱仪，配Waters 2414示差折光检测器，美国Waters 公司；Waters synapt UPLC-Q-TOF质谱仪，美国Waters公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters NH2 分析柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈/水=70/30；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。

1.3 UPLC-Q-TOF串联质谱条件

(1) UPLC条件：色谱柱：Waters NH2 分析柱（4.6mm×200mm，3μm）；流动相：乙腈/水=70/30；流速：0.4mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL。

(2) Q-TOF MS条件：质谱采用电喷雾电离源(ESI)，TOF离子飞行方式采用V模式。四极杆质量扫描范围m/z 150~2000，一次扫描时间为0.1s，离子源温度100℃，脱溶剂氮气流速400 L/h。负离子电离模式，毛细管电离电压3 kV，取样锥孔电压50V，碰撞能量分别为10和20 V。

2 结果与分析

2.1 三糖、四糖异构体的确证及其对检测影响

由以上色谱条件测得低聚果糖色谱图如图1所示，根据标样的保留时间定性可知6.919min、7.539min 和9.206min对应的糖分别为果糖、葡萄糖和蔗糖，13.276min、17.927min、24.230min对应的物质分别为蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。那么蔗果三糖附近12.386min和14.672min的小峰是否可推测为三糖的异构体？同样，四糖附近的小峰是否也是四糖的异构体？为此，我们通过LC-MS-MS对这几个小峰进行了进一步的定性分析和确认。

图1 低聚果糖液相色谱图

按1.3质谱条件，测得总离子流图和选择离子流图如图2，由质谱图（图3）可知，15.13min、16.36min、18.36min出峰物质以负离子方式扫描得到准分子离子峰[M-H]- m/z＝503.1，这三种物质分子量均为504.1，和蔗果三糖的分子量一致。22.65min、25.17min出峰物质以负离子方式扫描得到准分子离子峰[M-H]- m/z ＝665.2，这两种物质分子量均为666.2，和蔗果四糖的分子量一致。

质谱分析的结果表明上述推测是正确的，在蔗果三糖附近的小峰确是三糖的异构体，蔗果四糖附件的小峰确是四糖的异构体。目前关于低聚果糖分析的文献，包括GB/T23528-2009，均未考虑异构体的含量；如此定量，无论是外标法还是归一化方法，其结果均会偏低。

图2 低聚果糖总离子流图和选择离子流图16.36min

15.13min

18.36min

22.65min

25.17min

图3 各对应色谱峰的MS/MS图谱

2.2 定量方法对低聚果糖检测的影响

在GB/T23528-2009 “6.5.1原理”中指出：低聚果糖采用外标法或峰面积归一化法定量，以外标法为仲裁法。但在“6.5.4.2.3的注3” 指出：由于果-果型3-6糖没有标样，以菊芋、菊苣为原料的低聚果糖含量计算宜采用峰面积归一化法。两处论述相互矛盾，以何为准？

根据上述注3，以菊芋、菊苣为原料的低聚果糖计算含量采用峰面积归一化法。若聚合度均为10以下，用氨基柱分离，以乙腈/水为流动相，所有糖组分都可以出峰，即可以用归一化法定量。但若样品为菊粉，聚合度为2-60左右，在标准所述色谱条件下，聚合度较大的糖组分不能完全出峰，此时，用归一化法的结果会比实际含量高得多。

另外，对于蔗-果型低聚果糖，用外标法和归一化法的结果可能会相差较大，用外标法计算结果时，由于标样纯度、称重和进样体积误差等因素的影响，其重复性、重现性及准确性也会较差。

2.3 检测器对低聚果糖检测的影响

由于低聚果糖仅在低波长有较弱的紫外吸收，故GB/T23528-2009规定对其检测时选用示差折光检测器（RI）和蒸发光散射检测器（ELSD）。但若用ELSD检测，采用外标法计算时不能如该标准所述用6.5.4.3.1中式（1）计算。因为对于ELSD，糖组分浓度（质量）与峰面积不成线性关系，往往是取对数以后才近似成线性关系。同理，用ELSD检测时，也不可以用归一化法定量。

3 讨论

根据以上的分析，我们对GB/T23528-2009标准规定的低聚果糖检测方法有以下两点建议：①对于蔗-果型低聚果糖和聚合度均小于10的果-果型低聚果糖，使用归一化法定量；对显著含有聚合度大于10的糖组分的果-果型低聚果糖，采用外标法定量，以高纯度果糖的定量校正因子近似计算各糖组分的含量。②检测器应以示差折光检测器为第一选择，并以此检测方法为仲裁法。因为示差折光检测器比起ELSD检测线性较好，仪器较普及。

参考文献（略）