第九章_细菌感染分子生物学检验

结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得 治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有 高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组 中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包 括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多 药物外排泵系统。
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长
具有合成所有必需氨基酸、维生素和酶辅助因子 的潜在能力。该菌具有代谢各种各样碳水化合物、 乙醇、酮和羧酸的能力。此外，还具有许多涉及 脂代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸和乙醛 酸循环所必须的酶分子。
的培养特点：馋、懒、丑。 馋营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、 甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基（罗氏）上 才能生长良好。 懒生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基上 2～5w才出现肉眼可见的菌落。 丑典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明， 乳白色或淡黄色，如菜花样。
是一种革兰氏阳性菌，含量高，其细胞壁除肽聚 糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖脂和多 糖组成的附加层。呈细长略弯曲，常聚集成团， 用抗酸性染色被染成红色。
对养要培求特殊条件，一 般要经4-6周才出现肉眼可 见的菌落。通过呼吸道、 消化道和破损的皮肤粘膜 侵入机体，它被吞噬后能 在吞噬细胞内繁殖，导致 巨噬细胞裂解，还可在细 胞外繁殖。
传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学、 微生物学和血液学等相关技术，但这些技术方法受灵 敏度和特异性的限制，不易达到早期诊断。
利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质 （或），从而达到早期、快速、敏感、特异地检测已 经成为临床检验的主流技术之一。
第一节 细菌感染的分子生物学检验策略
分子生物学检验是以核酸（或）或蛋白质分子 为检验目标，通过检查人体内源基因或外源 （病原体）基因的存在、缺陷或表达异常，对 人体状态或疾病作出特异性诊断的方法和过程。
二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容
（一）结核分枝杆菌核酸的检测
可采用、 、、线性探针杂交、链替代扩增技术、 扩增结核分枝杆菌直接试验、基因芯片技术、 全自动结核检测平台等方法检测标本中的 。
1、 扩增所选靶序列主要有65抗原基因、蛋 白基因、基因、 6110插入序列、染色体的重复 序列等。常规的不足：产物的交叉污染、假阳 性、假阴性、实验室污染。
在H37 全基因组中有16个拷贝的6110插入序列和6个拷贝的 1018，大多数插入序列位于基因间或非编码区，通常靠近 基因聚集成串，插入序列在染色体中主要分布在重复区。
H37 基因组中共有3924个开放阅读框，其中 91%有潜在的编码能力，中最常见的起始密码子 61%为，35%为。 187个参与脂类代谢、细胞壁合成， 360个参与细胞壁代谢， 66个参与脂类合成， 287个参与能量代谢， 95个参与氨基酸合成， 38个与细菌毒力相关， 69个参与合成。 所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的 与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。 不同菌株之间存在多个差异基因。 基因组中有3个毒力因子：、过氧化氢酶-过氧化 物酶和。除了这些单基因毒力因子，细菌的胞壁 也对致病性起着重要的作用。
第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验
结核分枝杆菌()，简称结核杆菌，是引起结核病 的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生生 活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大 幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药 菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及 人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫情 死灰复燃。 据统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝杆菌， 在某些发展中国家成年人中群中结核分枝杆菌携 带率高达80%，其中的510%携带者可发展为活动 性结核病。
临床分子生物学检验
第九章
细菌感染的分子生物学检验
湖南省中医药大学生化与分子生物学教研室
细菌感染是致病菌或条件致病菌入侵机体，并在机体 中生长繁殖，产生毒素或其他代谢产物所引起的全身 性感染，临床上以寒战、高热、关节疼痛等为特征， 部分患者还可以出现烦躁、四肢厥冷、发绀、呼吸加 速、血压下降、感染性休克等临床症状。
2、 与传统相比，具有敏感度、特异性高及方 便快速等优点，特别是对难以培养与生长缓慢 的结核杆菌的检测更有优势。
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3、 通过扩增分枝杆菌染色体上一段，将扩增产物经 限制性内切酶消化（最常用的内切酶是Ⅱ)，将消化的样 品进行琼脂糖凝胶电泳分析，不同分枝杆菌酶切片段的 数量或大小不同，电泳图谱呈现多态性。
期使用易产生耐药性） 变异性 ※典型形态→多形性 ※ R型菌落→S型菌落 ※有毒→无毒（用于制备疫苗） ※抗结核药敏感→耐药
目前结核杆菌常规检测方法
痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。 培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌生 长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。 血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广 泛的交叉，特异性不强。
机体感染细菌后，应用分子生物学技术直接测 定这些细菌病原体基因，不仅可以对微生物感 染作出明确诊断，同时也能诊断出带菌者或潜 在性感染，还可以对感染性病原体进行分型和 耐药性监测。
一、细菌感染的一般性检出策略 细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就 是以感染病原体的特异核酸序列作为检测目标 序列，利用分子生物学技术对目标序列进行检 测，从而直接判断有无细菌感染和是何种病原 体感染。 二、细菌感染的完整性检出策略 完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准 确诊断，还需要对其进行分型（包括亚型）和 耐药性等方面的检测，尽可能地为临床诊疗提 供更为详尽的细菌病原体的相关信息。
一、结核分枝杆菌的基因组结构特征
H37 全基因组为环状双链，长约4 411 529，共有4000基因， 平均 值65.6%，其基因序列高度保守。 H37 基因组中有50 个编码功能 的 基因，其中 45 个 基因，3 个 基 因和 2 个核稳定（）基因，这些 分子是由特异的核糖体 操纵子产 生的。