细胞免疫功能检测方法

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➢ 在ELISPOT板的移动过程中 也要避免ELISPOT板的摇动， 否则会造成斑点的分布不均。
➢ 在细胞培养完成之前一定要 进行严格的无菌操作，试验 过程中各步的洗涤工作一定 要充分。否则会造成背景的 不清晰，针尖样杂斑的增多。
可Hale Waihona Puke Baidu辑ppt
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ELISPOT应用实例
当特异性抗原和T细胞结合后激活细胞释放出 IFN-Y，IFN-YELISPOT可灵敏的检测出T细胞 释出的IFN-Y，该方法己被用于多种CTL的检 测。Yang.J的研究表明，ELISPOT方法检测 CTL不但有高度的敏感性还有高度的特异性和 HLA限制性，在用LMP2肽段CLG作为激刺原 检测CTL时发现，只有相同HLA型别(HLA-A2) 的CDS+细胞能起阳性反应。
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ELISPOT的流程
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底板与捕捉抗体的包被
➢ 底板类型：硝酸纤维素膜板、PVDF膜板等 ➢ 捕捉抗体：如抗某细胞因子抗体（Purified
Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody）。 ➢ 抗体包被：用无菌PBS（PH9.6）来稀释包被 抗体，包被量通常在1-2μg/mL （1.25ug/ml ）。 ➢ 次日倾倒包被液，PBS洗涤数次，在灭菌吸水 纸上扣干后，用完全培养基37℃封闭2h。 ➢ 倾倒封闭液， 加入检测细胞进行细胞培养。
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标准曲线的建立和蛋白含量的确定
牛血清白蛋白含量（ug/ml）
➢ Ｆolin酚法（20ug/ml-
300
500mg/ml）
250
y = 629.1x
➢ NDV浓缩抗原作1:25稀
200
释，在650nm波长下比
150
色，吸光度为0.264,带
100
入回归方程式y=629.1x，
50
求得蛋白含量为166μg
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应用及展望
白细胞中能够分泌IFN-γ的细胞为TH2和CTL细胞,
活化条件对细胞内免疫染色IFNγ和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细 胞的影响
➢ Th0/Th1/Th2 细胞转换（Th1与Th2细胞亚群均来源于共同的Th0前体细 胞，抗原呈递细胞(APC)可活化Th0细胞。遗传因素、抗原类型、剂量、 有无佐剂以及抗原进入体内的途径，均可影响APC活化Th0细胞时的微环 境，而微环境中细胞因子的类型决定Th0细胞是否分化为Th1细胞或Th2 细胞）。
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ELISPOT检测的优点
灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有 一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测 出来。灵敏度高于ELISA 。 单细胞水平：ELISPOT 检测的是单个活细 胞的分泌。
操作简便：不需专门的实验仪器设备。可 按照标准化的实验操作，可以同时处理数 百个样品（Kalyuzhny AE 2005）。
2007-08-242007博士
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突变型乙型肝炎病毒前C-C DNA疫苗的基础研究张 敏中国人民解放军军医进修学院2007-07-052007博士
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欢 迎 各 位 老 师 同 学 提 出 宝 贵 意 见 ！
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ELISPOT与其他细胞免疫检测方法的 比较
➢ 老年哮喘患者外周血淋巴细胞内IFNγ与IL4的变化
➢ 疫苗研究开发：ELISPOT 检测已经成为评价疫苗细胞免疫反应最有效的 指标之一（Harrop R et. al., 2004）。对于某些持续性感染疾病，疫苗 的细胞免疫保护效果甚至居于主要地位
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IL-4可以促进B细胞分化、增殖,在IgE诱导合成 中起关键作用[4],诱导气道上皮细胞产生内毒 素,趋化嗜酸性粒细胞,加重气道炎症[5]. IFN-γ 与IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA 转录水平,并抑制由IL-4诱导的B细胞合成
IgE[6].
Th1/Th2亚群的失衡,与许多人类疾病有关,多 数认为,支气管哮喘中,Th2亚群及所属细胞因 子占优势,在该病的发生发展中作用重要[2,4]. 由于CD4+分子
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B7-H1/PD-1抑制途径对慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能影 响的研究陈良恩中国人民解放军军事医学科学院
0 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
/mL，所以NDV浓缩抗
吸光度
原的蛋白浓度为4150μg
/mL。
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脾淋巴细胞浓度对斑点数的影响
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培养时间对斑点数的影响
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NDV抗原浓度对斑点数的影响
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影响试验效果的其他因素
➢ 细胞是否具有活力是 试验成功进行的先决 条件，凡是活力高功 能保持完好的细胞， ELISPOT检测时必定 背景干净，阴性对照 斑点少，而试验组斑 点圆润鲜亮。
细胞免疫功能检测方法 ELISPOT的建立及应用
指导老师： 常维山教授 柴家前副教授 刘永庆教授
报告人：李梅
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ELISPOT是什么？
ELISPOT ： 全名为酶联免疫斑点检测。 它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，
能够在单细胞水平检测细胞因子等分泌物的分 泌情况 原理可概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌 的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现 出来（Sedgwick JD 2005）。
跟据间接ELISA结果判定标准（P/N>2.1），由表1OD450值可以看出， 小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分别为1.02、1.33、1.97和2.22， 抗体水平呈现逐渐升高的趋势，在第7天才出现抗体阳性。而机体的 IFN-γ水平则呈现先升高后降低的趋势，在免疫后的第三天达最高值， 此时分泌IFN-γ脾淋巴细胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小 鼠时，细胞免疫与体液免疫存在着一定的时差关系，在血清抗体阳性 检出的前期IFN-γ的分泌降至最低水平。