李金明-个体化医学检测质量保证指南(简)

样本的采集、运送和保存（2）

（5）样本运送温度和时间的要求。DNA检测样本，可室温下运送， 建议8h内送至实验室。靶核酸为RNA时，10 min可室温运送，如所需 运送时间较长，则应将样本置于冰上，必须保证样本与冰屑充分接触， 且冰屑应达到样本的高度，建议采集后4h内送到。 冰冻组织样本最好 保证其在运送过程中不发生融化，石蜡包埋组织则可在室温下运送。 （6）样本保存温度和时间的要求。用于DNA检测时，样本可在2~8℃ 保存72h。用于RNA检测时，样本一旦采集送达实验室后，如不能立 即提取，应冻存于-70℃。临床体液样本的长期保存（>2周）在保存 于-70℃。已提取纯化的RNA最好在乙醇沉淀后保存在-70℃。如果样 本中含有红细胞，应尽可能去除红细胞后，再进行冻存。石蜡包埋组 织则可在2-8℃长期保存。

纯化后的DNA和RNA的保存

DNA：如果纯化后的DNA无DNA酶的污染，则可 在TE缓冲液中室温保存26周；2-8℃保存一年；20℃保存7年；-70℃保存7年以上。怀疑可能存在 DNA酶污染的样本，则保存在-20℃以下。

RNA：RNA易于降解，在-20℃条件下，RNA酶 也可能发挥作用。因此，纯化后的RNA应当经过 乙醇沉淀，并在-70℃以下保存。
个体化医学检测质量保证指南
李金明 国家卫生计生委临床检验中心
适用范围

本指南适用于通过分析基因及基因结
构改变、基因表达及代谢变化，对患
者疾病进行预测、诊断、治疗决策、 监测和预后的临床检测。
标本采集、 运送和保 存（分析 前）
涉及临床医生 标本采集环节 和实验室
结果报告 解释及临 床应用 （分析后）
CLIA不要求，但CAP要求对定量进行LOD验证， 60个数据点（例如在预计的检测下限范围内5个样本，12次重复），研究时间5天， 使用在5天内收集的20个数据点 使用probit回归分析（或如果采用LOB研究，则使用SD加置信限） 定性检测：检测1个对照/天，共20天，或双份重 定性检测：最少3个浓度（LOD、LOD+20%、LOD-20％），获得40个数据点。 复/天，共10天。 定量检测：最少3个浓度（高、低和LOD），双管重复检测1~2次/天，检测20天， 定量检测：2个浓度的每1个检测2个样本（共4个 计算批内、批间、每天之间SD和/或CV，以及总的变异 样本），加1个对照，检测20天，或检测2个浓度， 3管重复，检测5天 CLIA不要求 未建议最小样本数量；检测样本相关的干扰物质（溶血、脂血、黄疸等）和遗传 上相似的微生物或具有相同临床表现同一样本位点可见到的微生物，加入低浓度 待测物质。采用t检测统计分析。 使用比较方法和拟评价方法至少5天进行双管重复检测，典型的40个以上的样本， 进行xy散点回归统计分析；采用Bland-Altman 差异描点，加偏倚测定; 使用kappa 统计学分析 % 符合率 如果在健康个体靶核酸不会存在，则属于定性检测，参考范围这“阴性”或“未 检测到”，则不需要进行参考区间研究。对于定量检测，参考区间可报告为低于 最低检测限（LOD或LLOD）；对于某些待测物，参考区间可能是一个临床决策限 （a clinical decision limit）；如果检测的预期用途限于已知被检测的待测物是阳性 的患者，则不适用参考区间。
剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家 所宣称的检测性能。）
如果不按商品 试剂盒说明书 操作或改变商 品试剂盒组份 是否可以？

可以 但属于实验室自 配试剂或自建方 法，亦即 Laboratorydeveloped tests, LDTs)

“性能确认”（“validation” ）定义

The FDA and ISO both define the term “validation” as “confirmation by examination and provision of objective evidence that the particular requirements for a specific intended use can be consistently fulfilled” .
性能验证与性能确认的实际操作区别
性能指标及所建议的 研究
可报告范围, 线性范围研 究(定量检测) 分析敏感性，测定下限 （LOD）研究 精密度, 重复实验
要
FDA批准的检测 覆盖所述线性范围内5~7个浓度，每个浓度双份 检测
求
实验室自建方法或自配试剂（LDT） 覆盖预计测定范围内（或超出所确定的最宽的可能范围的20〜30%）7~9个浓度， 每个浓度2~3个重复检测，进行多项回归分析
分析中的质量保证
临床基因扩增检验实验室设计
产物分析区 扩增区 标本制备区 试剂准备区
“各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作”
空气流向 空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间 工作流向
专用走廊
实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多 少及各区域的空间大小。 至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防 止污染、报告及时“作为基本原则。 缓冲间的功能是“控制空气的流向”。 生物安全柜可考虑“A2”。
产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）
测序区
空气流向 缓冲间 文库扩增 与检测区 空气流向 缓冲间 标本与文 库制备区 空气流向 缓冲间
试剂准备区
空气流向 缓冲间
专用走廊
工作流向
标本与文库制备区
文库扩增与检测区
测序区
植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)
电泳区 测序区 文库检测区 扩增一区 WGA制备区 试剂准备区
每次测定时 每年 2 次 每次实验 每年 2 次
理想的试剂
试剂方法的性能验证及每批试剂的质检 性能指标：

精密度（重复性） 准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等） 线性范围（定量） 分析特异性 测定下限 抗干扰能力
“性能验证”（“verification”）定义


“verification”： broadly as “confirmation through the provision of objective evidence, that specified requirements have been fulfilled” . （广义为通过提供客观证据证明特定 的要求得到满足） CLIA uses the term “verification”： specifically to relate to confirmation that the laboratory using a test can replicate the manufacturer’s performance claims when the test is used according to the package insert. （CLIA性能验证术语特指 使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试

或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过 程））
“validation” 通俗一点的定义

the term “validation” will be used to refer to the analytic performance characteristics that need to be initially established at the time of assay development. （指在测定方法研发时，最 早建立的分析性能特征）
患者的正确识别

在对患者进行取血或采样前，检验人员需要首先确 定患者的身份。 在对患者进行确认时，应准确核实患者的姓名、性 别、住院号等信息。对于不能说话的或意识不清醒 的患者应由相关陪同人员、医生或护士加以确认。 如果有腕带，患者的腕带上通常附有上述信息，采 血或取其他临床样本时检验人员应先确认这些信息。

常见标本的类型

血液 分泌物 胸腹水 痰 粪便 尿 脑脊液 胚胎样本 骨髓穿刺样本/细针穿刺细胞 组织（新鲜组织、活检组织、手术切除样本、甲醛固定的石蜡包埋组 织（FFPET） ）
临床分子诊断样本的接收

样本拒收标准：容器破损、量不够、时间不符 合要求、重度溶血、重度脂血、重度黄胆、无 靶细胞？ 用于肿瘤组织基因突变检测的样本，在分子检 测须由病理医师进行镜下肿瘤细胞评估，然后 富集肿瘤肿瘤细胞用于核酸提取。肿瘤细胞所 占比例应达到所用扩增检测方法的要求
涉及实验室人 员和临床医生
质量 保证
室间质评 （分析中）
室内质控 （分析中）
涉及实验室
涉及实验室
分析前质量保证
申请单应包括的内容





1. 患者的惟一标识：患者的姓名、出生日期、性别、民族、 住院号、就诊科室、床号，有条件的医院尽量使用条码标 志或其他唯一标示； 2. 样本的类型：血液、其他体液、活检组织、手术切除样 本等； 3. 所申请的检验项目； 4. 患者的相关临床资料，包括初步诊断结果； 5. 样本采集日期和采集时间； 6. 实验室接受样本的日期和时间； 7. 与检验有关的既往史等； 8. 样本是否合格：有无癌变组织、血液样本有无溶血、容 器有无破损等。 9. 医生的签名。


样本的采集、运送和保存（1）

1. 基本原则 （1）应按照CFDA批准的检测试剂说明书制订的标准操作程序 （SOP）进行。如为实验室自制试剂，则实验室应当建立样本的采集、 运送和保存的SOP，并严格执行。 （2）样本采集和运送容器：密闭的、一次性、无菌、无核酸酶及其 他扩增抑制物。血液和骨髓穿刺样本通常需要先抗凝，抗凝剂一般应 EDTA和枸橼酸盐，避免使用肝素。如检测的靶核酸为胞内RNA，试 管内应含有一定量的RNA稳定剂。 （3）实验室应向样本采集人员明确以下信息（如有可能体现在申 请单中），具体包括：采集时间；采集部位；样本类型；采集量；采 样质量的要求；拒收样本的类型。 （4）样本运送和保存中的生物安全。
DNA打断区
标本与文库制备区 标本与文
库制备区
空气流向 缓冲间 缓冲间 空气流向 缓冲间
试剂准备区
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 空气流向 缓冲间
专用走廊
实验室仪器设备及管理
加样器：维护、校准 扩增仪：维护、校准 恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准 离心机：维护

（通过检查和提供客观证据证明，对一特 定预期用途的要求始终能得到满足） The FDA and ISO terms for verification and are similar, with the distinction having to do with intended use. （性能验证和性能确认 FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期 用途”）
“intended use”预期用途

The term “intended use” in these documents is established by the manufacturer or developing laboratory at the time of assay development and has to do with the purpose and population for which the test was intended (e.g., diagnosis, following treatment, etc.). Relevant performance characteristics are then determined based on the intended use of the test. Some people interpret “intended use” as referring to the relevant clinical laboratory in which the test is performed, rather than the manufacturer or developing laboratory, thus causing confusion. The World Health Organization (WHO) defines validation as “the action (or process) of proving that a procedure, process, system equipment or method used works as expected and achieves the intended result” . （WHO将 validation定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备
空气流向
空气流向
缓冲间
空气流向
缓冲间
空气流向
缓冲间
空气流向
缓冲间
空气流向
缓冲间
缓冲间
专用走廊
遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）
电泳区
测序区 测序区
文库检测区 文库检测区
文库扩增区 文库扩增区 （扩增二区） （扩增二区）
杂交捕获区 杂交捕获区 （扩增一区） （扩增一区）
生物安全柜：维护
冰箱：维护
基因扩增仪器设备的质控
仪器设备
扩增仪
质控方法
仪器校验实验 热电偶监测温度
频
度
失控标准
实验失败 如靶温度或温度 差异超出允许范 围 待测孔未出现扩 增，检测温度 打印程序不对 不符合要求 不符合要求 不符合要求
当仪器移动时 每月一次
扩增功能检测
每 4 个Biblioteka Baidu一次
程序打印 加样器 水浴箱 酶标仪 校准 温度检测 预防性维护 及校准