第24章 病毒与细胞的相互作用.ppt
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病毒与细胞间的相互作用
第一节 病毒的细胞培养 第二节 病毒与细胞的相互作用
第一节 病毒的细胞培养
病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养 病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏 感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或 离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
实验动物、鸡胚都拥有大量活的细胞， 可用于病毒培养。
第二节 病毒与细胞的相互作用
杀细胞感染 非杀细胞感染
引致持续感染，对细胞代谢无影响。
产生干扰素
一、病毒引致的杀细胞变化
（一）细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)
由病毒感染导致的细胞损伤。CPE能在光学显微镜下观察。 ①细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等； ②细胞聚合，如腺病毒； ③细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒； ④有些病毒能形成包涵体。
旋转培养（roller culture） 基本方法与静置培养相 同，不同之处是要培养的细胞不是静置，而是使之不 断缓慢旋转（5~10r/h），经过一段时间，细胞可在培 养瓶（管）的四壁长满单层。此法的产量高，适用于 疫苗生产。
悬浮培养（suspensive culture） 通过搅拌 使细胞处于悬浮状态，并补充营养和校正pH， 使之生长或维持存活。此法适用于某些不需要 贴壁生长的细胞系，如NS-1（一种骨髓瘤细胞 系），或作某种特殊研究之用。
接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。
按病毒侵袭部位不同选择适当 的接种途径。嗜神经病毒接种 在小鼠的脑内。痘苗病毒和单 纯疱疹病毒接种于家兔角膜。
动物接种的优缺点：
优点：（1）不需要复杂的仪器设备； （2）技术简单； （3）易成功
缺点：（1）个体差异大 （2）价格昂贵 （3）数量有限 （4）需要隔离畜舍
PRRSV仅在猪肺巨噬细胞、Marc-145 细胞及非洲绿猴肾细胞系MA-104生长
PCV2常用PK15细胞培养
培养方法
常用的有静置培养和旋转培养，旋转培 养产率更高
大部分的病毒以静置培养为主
如轮状病毒，初次分离时旋转培养成功 率较静置培养为高。
鸡胚
图3426-1 鸡胚接种途径示意图（据Flint等）CP观察正常细胞CPE
CPE观察
正常单层A72细胞
接种CCV后出现细胞拉网 的的单层A72细胞
CPE观察
正常单层A72细胞
接种犬冠状病毒（CCV）后形 成合胞体的的单层A72细胞
SARS-CoV in various cell lines
RD
293
HeLa
细胞肿大
细胞圆缩
病毒所致的细胞病变
尤其是SPF动物或SPF鸡胚，目前仍然经 常供培养病毒之用，但是发展最快的技 术是细胞培养。
动物细胞培养一般流程
优点：
每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等 无个体差异，准确性和重复性好 可严格执行无菌操作 细胞培养本身就能显示病毒的生长特征 应用空斑技术可进行病毒的克隆化
细胞培养的类型
微载体培养（micro-carrier culture） 是在 悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技 术。微载体是直径100~35μm的微小颗粒，对 细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于 微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常 规方法大为增加，对规模化的细胞或疫苗生产 很有吸引力，虽则增高了生产成本。此技术还 适用于某些不能悬浮培养的细胞，如二倍体细
/mainweb/swx/op/sjjx-jxkj.asp
一般营养要求及培养条件
培养基： 状态:
液体培养液（动物细胞生活的液体环境） 成分:
葡萄糖（满足能量需求、作为细胞碳源） 氨基酸（合成蛋白质） 无机盐（重要的细胞组成物质） 维生素、动物血清等 （生长调节作用） 条件: 恒温（ 动物细胞生长温度） 无菌条件（防止微生物污染） 一般还需要一定浓度的二氧化碳
原代细胞（primary cell） 动物组织经胰蛋 白酶等消化、分散，获得单个细胞，再生长 于培养器皿中。
大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快 慢及难易程度不一。
原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于 胚胎或幼畜组织的细胞。
最好用SPF动物的组织，以免携带潜伏的病毒
二倍体细胞株（diploid cell strain） 将长成的原代细胞消化分散成单个细胞， 继续培养传代，其细胞染色体数与原代 细胞一样，仍为二倍体。
细胞培养应用范畴
（1）生产有重要价值的蛋白质产品分泌性的蛋白质产品 （2）培养皮肤细胞用于移植形成组织 （3）检测有毒物质致癌致畸引起染色体目和结构改变 （4）理论研究:培养正常或异常细胞用于生理、病理、药
理研究 (5) 病毒的分离鉴定
应用举例
病毒对细胞的选择性
猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪 甲状腺原代或二倍体细胞等培养。
依据不同的病毒种类，选择适当的接种 途径，通常接种尿囊腔，如新城疫病毒 等。
特殊情况可接种包括卵黄囊、绒毛尿囊 膜和羊膜腔等，如鸡痘病毒接种绒尿膜。
鸡胚接种的优缺点：
优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大， 不需特殊设备
缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。
实验动物
一、动物接种
形成合胞体
b
a
A
B
A:正常A72细胞(A72); B:CCV感染后，导致的合胞体细胞 (a)及凋亡现象(b)
细胞培养的方法
静置培养（stationary culture） 将消化分散的细胞 悬液分装于培养瓶（管）或培养板（孔），封闭，静 置于恒温箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。 一般培养在含5%的CO2条件。哺乳动物及禽类的细胞 培养温度一般为37℃，鱼类等变温动物则视其生存环 境的温度而定，温水鱼细胞一般25℃~28℃，冷水鱼 细胞15℃~20℃。昆虫细胞培养有特殊的培养条件。
此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性 则基本无变化。从样本中分离培养病毒， 一般多采用此种细胞。
传代细胞系（established cell line） 与上述两类细胞不同，这类细胞在体外 可无限制分裂，亦即可无限制传代。
有的来源于肿瘤组织或转化的细胞，染 色体数目不正常，为异倍体。
细胞培养所需要的一般器材
第一节 病毒的细胞培养 第二节 病毒与细胞的相互作用
第一节 病毒的细胞培养
病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养 病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏 感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或 离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
实验动物、鸡胚都拥有大量活的细胞， 可用于病毒培养。
第二节 病毒与细胞的相互作用
杀细胞感染 非杀细胞感染
引致持续感染，对细胞代谢无影响。
产生干扰素
一、病毒引致的杀细胞变化
（一）细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)
由病毒感染导致的细胞损伤。CPE能在光学显微镜下观察。 ①细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等； ②细胞聚合，如腺病毒； ③细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒； ④有些病毒能形成包涵体。
旋转培养（roller culture） 基本方法与静置培养相 同，不同之处是要培养的细胞不是静置，而是使之不 断缓慢旋转（5~10r/h），经过一段时间，细胞可在培 养瓶（管）的四壁长满单层。此法的产量高，适用于 疫苗生产。
悬浮培养（suspensive culture） 通过搅拌 使细胞处于悬浮状态，并补充营养和校正pH， 使之生长或维持存活。此法适用于某些不需要 贴壁生长的细胞系，如NS-1（一种骨髓瘤细胞 系），或作某种特殊研究之用。
接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。
按病毒侵袭部位不同选择适当 的接种途径。嗜神经病毒接种 在小鼠的脑内。痘苗病毒和单 纯疱疹病毒接种于家兔角膜。
动物接种的优缺点：
优点：（1）不需要复杂的仪器设备； （2）技术简单； （3）易成功
缺点：（1）个体差异大 （2）价格昂贵 （3）数量有限 （4）需要隔离畜舍
PRRSV仅在猪肺巨噬细胞、Marc-145 细胞及非洲绿猴肾细胞系MA-104生长
PCV2常用PK15细胞培养
培养方法
常用的有静置培养和旋转培养，旋转培 养产率更高
大部分的病毒以静置培养为主
如轮状病毒，初次分离时旋转培养成功 率较静置培养为高。
鸡胚
图3426-1 鸡胚接种途径示意图（据Flint等）CP观察正常细胞CPE
CPE观察
正常单层A72细胞
接种CCV后出现细胞拉网 的的单层A72细胞
CPE观察
正常单层A72细胞
接种犬冠状病毒（CCV）后形 成合胞体的的单层A72细胞
SARS-CoV in various cell lines
RD
293
HeLa
细胞肿大
细胞圆缩
病毒所致的细胞病变
尤其是SPF动物或SPF鸡胚，目前仍然经 常供培养病毒之用，但是发展最快的技 术是细胞培养。
动物细胞培养一般流程
优点：
每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等 无个体差异，准确性和重复性好 可严格执行无菌操作 细胞培养本身就能显示病毒的生长特征 应用空斑技术可进行病毒的克隆化
细胞培养的类型
微载体培养（micro-carrier culture） 是在 悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技 术。微载体是直径100~35μm的微小颗粒，对 细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于 微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常 规方法大为增加，对规模化的细胞或疫苗生产 很有吸引力，虽则增高了生产成本。此技术还 适用于某些不能悬浮培养的细胞，如二倍体细
/mainweb/swx/op/sjjx-jxkj.asp
一般营养要求及培养条件
培养基： 状态:
液体培养液（动物细胞生活的液体环境） 成分:
葡萄糖（满足能量需求、作为细胞碳源） 氨基酸（合成蛋白质） 无机盐（重要的细胞组成物质） 维生素、动物血清等 （生长调节作用） 条件: 恒温（ 动物细胞生长温度） 无菌条件（防止微生物污染） 一般还需要一定浓度的二氧化碳
原代细胞（primary cell） 动物组织经胰蛋 白酶等消化、分散，获得单个细胞，再生长 于培养器皿中。
大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快 慢及难易程度不一。
原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于 胚胎或幼畜组织的细胞。
最好用SPF动物的组织，以免携带潜伏的病毒
二倍体细胞株（diploid cell strain） 将长成的原代细胞消化分散成单个细胞， 继续培养传代，其细胞染色体数与原代 细胞一样，仍为二倍体。
细胞培养应用范畴
（1）生产有重要价值的蛋白质产品分泌性的蛋白质产品 （2）培养皮肤细胞用于移植形成组织 （3）检测有毒物质致癌致畸引起染色体目和结构改变 （4）理论研究:培养正常或异常细胞用于生理、病理、药
理研究 (5) 病毒的分离鉴定
应用举例
病毒对细胞的选择性
猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪 甲状腺原代或二倍体细胞等培养。
依据不同的病毒种类，选择适当的接种 途径，通常接种尿囊腔，如新城疫病毒 等。
特殊情况可接种包括卵黄囊、绒毛尿囊 膜和羊膜腔等，如鸡痘病毒接种绒尿膜。
鸡胚接种的优缺点：
优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大， 不需特殊设备
缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。
实验动物
一、动物接种
形成合胞体
b
a
A
B
A:正常A72细胞(A72); B:CCV感染后，导致的合胞体细胞 (a)及凋亡现象(b)
细胞培养的方法
静置培养（stationary culture） 将消化分散的细胞 悬液分装于培养瓶（管）或培养板（孔），封闭，静 置于恒温箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。 一般培养在含5%的CO2条件。哺乳动物及禽类的细胞 培养温度一般为37℃，鱼类等变温动物则视其生存环 境的温度而定，温水鱼细胞一般25℃~28℃，冷水鱼 细胞15℃~20℃。昆虫细胞培养有特殊的培养条件。
此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性 则基本无变化。从样本中分离培养病毒， 一般多采用此种细胞。
传代细胞系（established cell line） 与上述两类细胞不同，这类细胞在体外 可无限制分裂，亦即可无限制传代。
有的来源于肿瘤组织或转化的细胞，染 色体数目不正常，为异倍体。
细胞培养所需要的一般器材