大肠杆菌培养基的优化及发酵罐操作

发酵操作 ������
当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后， 进行如下操作： 1、取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残 液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料 瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶， 开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3 2、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口， 点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入 二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种 后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。
溶氧控制的分批补料培养
控制的几个关键参数如下： 1、温度：培养温度为37 ℃。 2、pH：自动流加30%的氨水，使PH保持 在7.0左右。 3、葡萄糖的流加：根据发酵的实际经验，流 加补料分三个阶段进行，发酵过程中0~4h 不加补料，4~10h补加含50g葡萄糖的补料， 10~20h加入含190g葡萄糖的补料，诱导前 0.5h追加100ml补料。
大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物 乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。 预防措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：比生长 速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值 时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度， 控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养：在大肠杆菌的培养过程中可以用透析 技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实 现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度：葡萄糖是大肠杆菌发酵过程 中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个 较低的水平上，以减少乙酸的产生。
发酵过程中各生化指标的测定
（4）定时取样用裴林快速定糖法测定培养液中还原糖的含 量。测定步骤如下： ①发酵液中糖含量小于 4％时，直接取发酵液 0.5 ml于锥 形瓶中，若糖含量大于 4％时，先稀释10倍后，取稀释液 0.5ml于锥形瓶中。 ②向锥形瓶加入裴林试剂甲液和乙液各 5ml，混匀，加热 至沸腾。 ③用0.1％标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖 液的体积数（V）。 ④取0.5 ml蒸馏水于锥形瓶中，同法进行滴定，记录消耗 葡萄糖的体积数（V0）。 ⑤按下公式进行计算：(V0-V)x0.1/0.5x稀释倍数 V0 为葡萄糖滴定空白时消耗的毫升数。V为葡萄糖滴定 样品时消耗的毫升数。
发酵罐
上罐前的准备及实罐灭菌
5、当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时， 2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时， 微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀S1维持 罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷 凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设定 在37℃，切入自动。 6、当温度降到100℃以下，缓缓开排气阀V4， 使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。
上罐前的准备及实罐灭菌
7、连接通气管路，将进气过滤器K7口与控 制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通 空气压缩机电源， 对发酵罐进行通气， 调 整空气流量3 ～5L/min。 8、当温度达到37℃时，将预先灭菌的pH电 极、DO电极（75%酒精消毒、UV消毒）接 入发酵罐，连接各电极导线。
上罐前的准备及实罐灭菌
发酵过程中各生化指标的测定
（6）测定OD值 ⑴ 大肠杆菌标准曲线的绘制：取10mL离心管，与105℃烘 2h至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平 上称重（W0），精确到小数后4位，然后准确取10mL发 酵液，于3000rpm离心10min，弃去上清液，用蒸馏水洗 涤沉淀，同上离心，弃上清液，与100℃烘至恒重，用镊 子夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（W1），精 确至小数后4位，得细胞干重为W1-W0。取同一发酵液， 稀释2、5、10、20、50倍，于600nm下测OD值。以0D 值为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。 ⑵ 均匀取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一 定浓度，在721分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与 吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。 ⑶ 其余发酵液于3℃，2000r/min条件下离心分离8min,上 清液装入编号三角瓶，用于测糖。
发酵过程中各生化指标的测定
（5）定时取样测定发酵液中氨基氮的含量，测定步骤如下： ①取发酵液经3500 r／min离心 10min。 ②分别吸取上清液 2.0 ml于两个磨口具塞锥形瓶中，各 加蒸馏水 5ml。向另一磨口具塞锥形瓶中加入 7 ml蒸馏 水，作空白对照。 ③向上述 3个瓶各加中性申醛溶液 5.0 ml，混匀，加 0.5 ％溴麝香草酚兰液 2滴和 0.5％酚酞液4滴。 ④用标准 0.100mol／L NaOH溶液滴定至紫色，分别记录 消耗的NaOH液毫升数。 ⑤按下式计算: (V0-V)x1.4008 V为滴定发酵液时消耗NaOH溶液的毫升数。V0 为滴定空白 时消耗NaOH溶液的毫升数。1.4008为 1ml 0.1mol／LNaOH 溶液相当的氮毫克数，氨基氮的含量是每毫升中的含量。
大肠杆菌高密度发酵
第二组 小组长：李青 小组成员：韩娇月、李洋、冯春红、胡建 贝、倪娜娜、常亚培、许志扬、李瑞兵、 郭荣欣
目录
大肠杆菌 高密度发酵 培养基选择 培养基配置 培养方式 培养条件 操作流程 具体步骤 参数控制 注意事项
大肠杆菌
大肠杆菌是基因工程中常用 的宿主菌,许多有价值的多肽和 蛋白在大肠杆菌中已成功地进 行了表达,表达水平有些高达细 胞总蛋白的30%以上. 大肠杆 菌作为外源基因表达的宿主,由 于具有遗传背景清楚,目的基因 表达水平高,技术操作、培养条 件简单,抗污染能力强,大规模 发酵经济等优点,倍受遗传工程 专家重视,是目前应用最广泛, 最成功的表达体系.
发酵过程中各生化指标的测定
（7）当发酵到一定时候，光密度值达到1～ 1.5，发酵液中还原糖和氨基氮含量较低时， 开始补料，并在发酵结束前一小时终止。 （8）每小时记录发酵过程温度、pH和DO的测 定数值，并记录操作情况。
大肠杆菌流加发酵策略
大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株， 广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培 养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生， 因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度 乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研 究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大 肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所 采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保 持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最 好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可 以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于 饥饿状态。
9、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面 板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使 胶管内充满液体，将输出上限设在15%， 下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手 动”开关调节到“自动”状态。 10、设定搅拌转速为300r/min、空气流量 2～3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入 发酵状态。
发酵过程中各生化指标的测定
发酵过程中，虽然能自动控制温度和pH两个 重要条件，但仍需专人负责照看。完成下列工作： （1）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控 制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。 （2）每小时取样测定细菌光密度值，进行革兰 氏染色及镜检，以了解菌生长情况及检查是否有 杂菌污染。 （3）随着培养时间的延长，适当地调节进气量 和搅拌转速，以维持一定的DO值。
菌种准备
1、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜 面，37℃培养24h。 2、上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子 瓶， 37℃振荡培养12h，然后转接二级 种子瓶， 37℃振荡培养10h。
百度文库
上罐前的准备及实罐灭菌
1、洗净发酵罐及各联接胶管 2、 配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴 泡敌。 3、校正pH电极和溶氧（DO）电极。 4、把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等 固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1， 使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用 倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启 动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min， 开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1，进行在 位灭菌。
发酵管理
控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度、 空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及 时排除。 每小时取一次样，每次取样50ml。取样时先将空气流量计 旋钮调至0~1L/min，松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管 残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松 开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入量筒，当达到40mL，开 J2排出取样管内残料，夹紧J3、J2。将样液入标记有取样 时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样 要及时清洗量筒。 每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、 通风、转速的测定数值，并记录操作情况。
培养条件
1、温度：36~38 ℃ 2、pH： 7 3、搅拌速率：100~200r/min 4、溶氧: 20~50% 5、通风：2~3L/min 6、接种量：1~2%
操作步骤
1、菌种准备 2、上罐前的准备及实罐灭菌 3、发酵操作 4、发酵管理 5、发酵过程中各生化指标的测定 6、补料 7、放罐 8、清洗
放罐
发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵 液的PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢， 且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准 备放罐。 放罐操作同取样。将全部发酵液取出后， 100℃煮沸10分钟灭菌，灭完菌的发酵液可 排放入下水道。
培养基配制
配制种子固体培养基100mL ， 分装试管， 0.1MPa 灭菌20min，然后摆成斜面。 配制种子培养液600mL，分装50mL于一个 250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下 550mL平均分装于三个500mL三角瓶中（作 二级种子用），同上灭菌。
培养方式
微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。 大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工 艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中 的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一 方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现 象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞 的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各 样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。 培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补 料是提高细胞浓度和外源蛋白产量的有效方式，高密度培 养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。
高密度培养技术
高密度培养技术：是应用一定的培养 技术和设备来提高菌体生物量和目标产物 时空产率的发酵技术。
利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组 建的基因工程菌的表达产物,大肠杆菌的生物量,表 达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低,难以获 得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发酵 不但可获得较高的生物量,而且可显著提高目的基 因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有较 高的要求,而且对发酵条件也有非常高的要求。影 响高密度发酵的因素非常多,如细菌生长所需的营 养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓 度、培养温度、发酵液的pH 值、补料方式及发 酵液流变学特性等。
培养基选择
LB培养基(种子培养基) :胰蛋白胨5g, 酵母粉2.5g,NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH调 节pH7.0, 2L三角瓶装,灭菌锅湿热高压灭 菌121℃, 20min,室温保存. TB培养基(发酵培养基) : 胰蛋白胨 240g, 酵母粉480g, 甘油80g, 消泡剂1ml, 溶于H2O, 定容至19L,B. Braun发酵罐在位 灭菌121℃, 15min.
补料方式
采用简单反馈控制补料，又称单一循 环法，此法控制与营养物利用相偶联的pH 或溶解氧浓度等参数,使之保持恒定。例如, 预先设定pH恒定值,发酵中菌体代谢产生酸 性物质或铵,使pH值发生改变,从而启动控制 开关,开始补料,pH恢复至恒定值以溶解氧浓 度作为补料开关则是根据培养基中某种关 键营养物(主要是碳源)消耗,会导致溶解氧 浓度迅速改变。