大肠杆菌培养基的优化及发酵罐操作

发酵操作 ������
当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后， 进行如下操作： 1、取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残 液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料 瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶， 开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3 2、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口， 点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入 二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种 后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。
溶氧控制的分批补料培养
控制的几个关键参数如下： 1、温度：培养温度为37 ℃。 2、pH：自动流加30%的氨水，使PH保持 在7.0左右。 3、葡萄糖的流加：根据发酵的实际经验，流 加补料分三个阶段进行，发酵过程中0~4h 不加补料，4~10h补加含50g葡萄糖的补料， 10~20h加入含190g葡萄糖的补料，诱导前 0.5h追加100ml补料。
大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物 乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。 预防措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：比生长 速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值 时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度， 控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养：在大肠杆菌的培养过程中可以用透析 技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实 现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度：葡萄糖是大肠杆菌发酵过程 中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个 较低的水平上，以减少乙酸的产生。
培养基配制
配制种子固体培养基100mL ， 分装试管， 0.1MPa 灭菌20min，然后摆成斜面。 配制种子培养液600mL，分装50mL于一个 250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下 550mL平均分装于三个500mL三角瓶中（作 二级种子用），同上灭菌。

培养方式
微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。 大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工 艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中 的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一 方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现 象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞 的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各 样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。 培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补 料是提高细胞浓度和外源蛋白产量的有效方式，高密度培 养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。
发酵过程中各生化指标的测定
（7）当发酵到一定时候，光密度值达到1～ 1.5，发酵液中还原糖和氨基氮含量较低时， 开始补料，并在发酵结束前一小时终止。 （8）每小时记录发酵过程温度、pH和DO的测 定数值，并记录操作情况。
大肠杆菌流加发酵策略
大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株， 广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培 养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生， 因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度 乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研 究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大 肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所 采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保 持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最 好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可 以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于 饥饿状态。
大肠杆菌高密度发酵
第二组 小组长：李青 小组成员：韩娇月、李洋、冯春红、胡建 贝、倪娜娜、常亚培、许志扬、李瑞兵、 郭荣欣
目录
大肠杆菌 高密度发酵 培养基选择 培养基配置 培养方式 培养条件 操作流程 具体步骤 参数控制 注意事项
大肠杆菌
大肠杆菌是基因工程中常用 的宿主菌,许多有价值的多肽和 蛋白在大肠杆菌中已成功地进 行了表达,表达水平有些高达细 胞总蛋白的30%以上. 大肠杆 菌作为外源基因表达的宿主,由 于具有遗传背景清楚,目的基因 表达水平高,技术操作、培养条 件简单,抗污染能力强,大规模 发酵经济等优点,倍受遗传工程 专家重视,是目前应用最广泛, 最成功的表达体系.
发酵过程中各生化指标的测定
发酵过程中，虽然能自动控制温度和pH两个 重要条件，但仍需专人负责照看。完成下列工作： （1）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控 制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。 （2）每小时取样测定细菌光密度值，进行革兰 氏染色及镜检，以了解菌生长情况及检查是否有 杂菌污染。 （3）随着培养时间的延长，适当地调节进气量 和搅拌转速，以维持一定的DO值。
9、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面 板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使 胶管内充满液体，将输出上限设在15%， 下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手 动”开关调节到“自动”状态。 10、设定搅拌转速为300r/min、空气流量 2～3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入 发酵状态。
发酵过程中各生化指标的测定
（4）定时取样用裴林快速定糖法测定培养液中还原糖的含 量。测定步骤如下： ①发酵液中糖含量小于 4％时，直接取发酵液 0.5 ml于锥 形瓶中，若糖含量大于 4％时，先稀释10倍后，取稀释液 0.5ml于锥形瓶中。 ②向锥形瓶加入裴林试剂甲液和乙液各 5ml，混匀，加热 至沸腾。 ③用0.1％标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖 液的体积数（V）。 ④取0.5 ml蒸馏水于锥形瓶中，同法进行滴定，记录消耗 葡萄糖的体积数（V0）。 ⑤按下公式进行计算：(V0-V)x0.1/0.5x稀释倍数 V0 为葡萄糖滴定空白时消耗的毫升数。V为葡萄糖滴定 样品时消耗的毫升数。
放罐
发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵 液的PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢， 且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准 备放罐。 放罐操作同取样。将全部发酵液取出后， 100℃煮沸10分钟灭菌，灭完菌的发酵液可 排放入下水道。
发酵过程中各生化指标的测定
（5）定时取样测定发酵液中氨基氮的含量，测定步骤如下： ①取发酵液经3500 r／min离心 10min。 ②分别吸取上清液 2.0 ml于两个磨口具塞锥形瓶中，各 加蒸馏水 5ml。向另一磨口具塞锥形瓶中加入 7 ml蒸馏 水，作空白对照。 ③向上述 3个瓶各加中性申醛溶液 5.0 ml，混匀，加 0.5 ％溴麝香草酚兰液 2滴和 0.5％酚酞液4滴。 ④用标准 0.100mol／L NaOH溶液滴定至紫色，分别记录 消耗的NaOH液毫升数。 ⑤按下式计算: (V0-V)x1.4008 V为滴定发酵液时消耗NaOH溶液的毫升数。V0 为滴定空白 时消耗NaOH溶液的毫升数。1.4008为 1ml 0.1mol／LNaOH 溶液相当的氮毫克数，氨基氮的含量是每毫升中的含量。
发酵罐
上罐前的准备及实罐灭菌
5、当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时， 2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时， 微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀S1维持 罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷 凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设定 在37℃，切入自动。 6、当温度降到100℃以下，缓缓开排气阀V4， 使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。
培养基选择
LB培养基(种子培养基) :胰蛋白胨5g, 酵母粉2.5g,NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH调 节pH7.0, 2L三角瓶装,灭菌锅湿热高压灭 菌121℃, 20min,室温保存. TB培养基(发酵培养基) : 胰蛋白胨 240g, 酵母粉480g, 甘油80g, 消泡剂1ml, 溶于H2O, 定容至19L,B. Braun发酵罐在位 灭菌121℃, 15min.
菌种准备
1、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜 面，37℃培养24h。 2、上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子 瓶， 37℃振荡培养12h，然后转接二级 种子瓶， 37℃振荡培养10h。
上罐前的准备及实罐灭菌
1、洗净发酵罐及各联接胶管 2、 配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴 泡敌。 3、校正pH电极和溶氧（DO）电极。 4、把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等 固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1， 使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用 倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启 动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min， 开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1，进行在 位灭菌。
发酵过程中各生化指标的测定
（6）测定OD值 ⑴ 大肠杆菌标准曲线的绘制：取10mL离心管，与105℃烘 2h至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平 上称重（W0），精确到小数后4位，然后准确取10mL发 酵液，于3000rpm离心10min，弃去上清液，用蒸馏水洗 涤沉淀，同上离心，弃上清液，与100℃烘至恒重，用镊 子夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（W1），精 确至小数后4位，得细胞干重为W1-W0。取同一发酵液， 稀释2、5、10、20、50倍，于600nm下测OD值。以0D 值为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。 ⑵ 均匀取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一 定浓度，在721分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与 吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。 ⑶ 其余发酵液于3℃，2000r/min条件下离心分离8min,上 清液装入编号三角瓶，用于测糖。
培养条件
1、温度：36~38 ℃ 2、pH： 7 3、搅拌速率：100~200r/min 4、溶氧: 20~50% 5、通风：2~3L/min 6、接种量：1~2%
操作步骤
1、菌种准备 2、上罐前的准备及实罐灭菌 3、发酵操作 4、发酵管理 5、发酵过程中各生化指标的测定 6、补料 7、放罐 8、清洗
发酵管理
控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度、 空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及 时排除。 每小时取一次样，每次取样50ml。取样时先将空气流量计 旋钮调至0~1L/min，松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管 残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松 开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入量筒，当达到40mL，开 J2排出取样管内残料，夹紧J3、J2。将样液入标记有取样 时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样 要及时清洗量筒。 每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、 通风、转速的测定数值，并记录操作情况。
上罐前的准备及实罐灭菌
7、连接通气管路，将进气过滤器K7口与控 制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通 空气压缩机电源， 对发酵罐进行通气， 调 整空气流量3 ～5L/min。 8、当温度达到37℃时，将预先灭菌的pH电 极、DO电极（75%酒精消毒、UV消毒）接 入发酵罐，连接各电极导线。
上罐前的准备及实罐灭菌
高密度培养技术
高密度培养技术：是应用一定的培养 技术和设备来提高菌体生物量和目标产物 时空产率的发酵技术。
利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组 建的基因工程菌的表达产物,大肠杆菌的生物量,表 达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低,难以获 得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发酵 不但可获得较高的生物量,而且可显著提高目的基 因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有较 高的要求,而且对发酵条件也有非常高的要求。影 响高密度发酵的因素非常多,如细菌生长所需的营 养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓 度、培养温度、发酵液的pH 值、补料方式及发 酵液流变学特性等。
补料方式
采用简单反馈控制补料，又称单一循 环法，此法控制与营养物利用相偶联的pH 或溶解氧浓度等参数,使之保持恒定。例如, 预先设定pH恒定值,发酵中菌体代谢产生酸 性物质或铵,使pH值发生改变,从而启动控制 开关,开始补料,pH恢复至恒定值以溶解氧浓 度作为补料开关则是根据培养基中某种关 键营养物(主要是碳源)消耗,会导致溶解氧 浓度迅速改变。