基因治疗血友病指南

血友病的基因治疗概述

血友病分为遗传性血友病和获得性血友病。前者是一组先天性单基因遗传性凝血因子Ⅷ(FⅧ)、IX(FIX)或者Ⅺ(FⅪ)缺乏而导致的凝血功能障碍的出血性疾病，而后者一般同时缺乏2种或者多种凝血因子，常继发于肝炎、肝硬化、肝癌转移等肝脏疾病，某些血液病(如急慢性白血病)、淋巴瘤、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和尿毒症等。我们主要就就遗传性血友病(简称血友病)的基因治疗作一综述。

1血友病的机理及传统治疗方法

血友病特点为早年发病，轻微外伤或小手术后的持续反复甚至自发出血，多有家族史并多发于男性。根据凝血因子所缺乏的种类可以分为血友病A(FⅧ缺乏)、血友病B(FIX缺乏)和血友病C(FⅪ缺乏)，血友病A约占血友病的85％，血友病C在临床上比较罕见，血友病A、B均为X染色体隐性遗传，而血友病C则为常染色体不完全隐性遗传。血友病的基础研究(包括血友病相关凝血因子的SNP、STS、STR等多态性位点)已经比较成熟，其基因突变有着高度的异质性，包括基因缺失、异常基因片段的插入、基因片段的重排和点突变等。对于小片段的缺失、插入和点突变来说，血友病的严重程度取决于该突变所在结构域的功能，但也有极少数血友病患者编码区及其旁侧序列并未发生突变。在FⅧ等凝血因子的转运过程中，许多蛋白质也参与其活性、非活性形式转换的调控，编码这些蛋白质基因的突变也会引起血友病样症状的出现。

随着发病率较高的疾病得到越来越好的诊治，以前被人们认为发病率较低的血友病，因其严重威胁着血友病患者的生活质量而越来越受到重视。目前血友病的传统疗法主要有替代疗法(对症补充血浆制剂和凝血因子浓缩制剂)、重组凝血因子疗法[3]和预防疗法等。替代疗法中患者会产生相应凝血因子的抑制物而抵消

3O％甚至更多的凝血因子活性，且存在传播病毒的危险。针对传统的浓缩或高纯凝血因子所产生的抑制物，临床上有采用猪FⅧ浓缩制剂来解决，因为猪FⅧ与抑制物的亲和力比人FⅧ要高的多；另外，绕过内源性凝血途径利用FⅧ旁路制剂(凝血酶原复合物(PCC)和激活的凝血酶原复合物(APCC))也可以促凝；目前有

1种新的旁路制剂，即重组活化的FⅦ(rⅦa)，由于它的酶促反应局限在细胞表面，所以大大降低了全身凝血活化和血栓并发症等副反应，其高效性和安全性已得到认可；但是高昂的治疗费用及副作用，使猪源性FⅧ及rFⅦa的应用均大打折扣[4]，通过基因工程方法生产的重组凝血因子虽然减少了传播病毒的危险，可也存在一些副反应(第1、2代制品)和理论上的危险[5]。预防疗法则主要是针对降低血友病发病率、提高患者生活质量而采取的措施。此外，中医药在血友病治疗上也取得了一定的进展，北京椿树医院血友病治疗中,6E报告了他们对424例血友病(A型、B型)患者采用中药治疗的情况，结果比较乐观，但相关的项目监测还有待进一步证明。以上疗法均需终身治疗且收费昂贵，因此血友病被形象地称为“贵族病”。基于传统治疗的缺点，2O世纪中末期兴起的基因治疗在血友病治疗领域的研究备受关注。

2血友病基因治疗

基因治疗是一种以改变基因表达为基础的治疗与预防遗传性疾病和多因素疾病的方法，它通过基因工程的实验手段，将正常基因(包括调控序列)导入基因缺陷的患者体内，使导入的基因发挥作用或使缺陷基因在原位得以校正和修复，从而纠正基因缺陷导致的各项异常表现。自1979年被首次运用于疾病治疗研究以来，基因治疗经过了准备期(1980—1989年)、狂热期(1990—1995年)和理性期(1996年至今)3个阶段[7]，这其问，因其所引发的毒副反应以及生殖细胞水平的基因治疗所涉及的一些伦理问题，曾一度处于停滞状态。国内自薛京伦等[8于1991年首次开展血友病基因治疗以来，血友病的基因治疗受到了广泛关注，并于2O 世纪末期有了长足进展。

血友病所以成为基因治疗研究的首选在于：1)血友病系单基因造成的凝血紊乱，基因水平上的发病机制已较为清楚，如FⅪ基因突变的相关数据库已建立(http：／／www．fac—torxi．org)。较之以前在血友病相关凝血因子基因、蛋白结构及其功能上的研究，近年来有不少学者致力于研究患者血小板聚集率以及FⅧ基因表达的调控[9]。2)正常血浆中凝血因子的含量很少[(g—mg)／L]，并且约正常凝血因子浓度的1O就可以维持正常凝血，而对于FⅧ缺乏患者来说，1％一5就能维持正常凝血[1。3)凝血因子在血浆中的水平没有很严格的调控，凝血因子在正常人群中的范围跨度较大，FⅧ、FIX的正常上限可达150。4)除肝脏能产生

凝血因子外，其它一些器官也能产生，靶器官的可选择范围较宽。5)凝血因子的相关基因已经克隆分离。6)构造动物模型时可选用体型较大的动物(如狗)，与人体环境较为相近。腺病毒载体于上世纪9O年代开始应用于人体内的基因治疗，在以小鼠、狗和猴子等动物为模型的实验中，均成功地表达了凝血因子并纠正了凝血紊乱的表型，这都显示出血友病基因的希望。随着载体在基因治疗中的重要性被人们所认识，载体的开发和改造也进一步深入和拓展，尤其是重组腺病毒的使用，使血友病的基因治疗有了可喜的前景Il。迄今为止，虽然尚无1项动物实验得到凝血因子终生持续表达的阳性结果，但长达几年的表达效果已显示出其巨大的潜在价值。1994年的首次临床实验方案采用了逆转录病毒载体途径；1995年则以人皮肤角质细胞为靶细胞，以鼠科白血病病毒为载体，将FIX的cDNA转入角质细胞中进行培养，结果外源基因稳定地整合到了角质细胞的染色体上。目前国际上关于血友病基因治疗的临床实验正在如火如荼地展开，GenStar公司研制的MAx—ADFⅧ腺病毒载体由1种普通的感冒病毒改造而成，该载体中所有与递呈病毒相关的基因都被编码FⅧ的基因所替代，目前MAX-ADFⅧ已进入临床试验阶段Il。Avigen生物技术公司用于治疗血友病B的Coagulin—B(TM)基因疗法通过肌内注射给药，临床试验进展良好，并已申请新药调查。我国在此研究领域起步较早，薛京伦等Il。]在国内首先开展了血友病B基因治疗研究，以皮肤成纤维细胞等为靶细胞，采用逆转录病毒、腺病毒及其相关病毒等介导的基因转移方法，作了人FIX的离体表达、动物试验和安全性检测等一系列研究，并早在1993年就进行了血友病B成纤维细胞的临床I期基因治疗试验，该课题组研制的AAV2一hFIX注射液已经获得国家食品药品监督管理局的药物I期临床研究批文，标志着我国血友病基因治疗已获得突破性进展。

3血友病基因治疗的影响因素及对策

目前影响基因治疗效果的主要因素包括载体引起的免疫反应、载体的安全性和外源基因不能持续高效表达等，解决的途径主要是选择合适的载体类型、适宜的载体剂量、载体进入宿主的途径以及特异性的靶器官等，除此之外，治疗时机的把握、患者情况的确认以及细胞因子对转入基因启动子的影响等也应考虑在内。3．1载体的类型主要分为病毒载体和非病毒载体，目前应用较多的是病毒载体。每种载体都有不同的应用对象，并且各有其优缺点。一般来说，AAV病毒[2]和