L-赖氨酸的故事：从代谢途径到工业生产

L-赖氨酸的故事：从代谢途径到工业生产

1导言

2 赖氨酸合成途径

3作为生产菌的谷氨酸棒杆菌

3.1 赖氨酸的合成

3.2中心碳代谢

3.3最大赖氨酸生产能力

4菌种工程

4.1经典工程

4.2赖氨酸合成的代谢工程

4.3 NADPH的代谢工程

4.4前体物质代谢工程

4.5通过系统生物方法的菌种工程

5工业生产过程

5.1大规模生产

5.2工艺优化

摘要

L-赖氨酸是一种动物和人类所必需的氨基酸，它在很多食品和饲料中是存在的，但是在很多情况下，高纯度的赖氨酸是被添加到饲料中的。随着对赖氨酸生化调控途径的研究以及微生物高产氨基酸能力的研究，在营养需求上，赖氨酸的重要性越来越突出。一个重要的里程碑是在1956年从土壤微生物中分离得到的谷氨酸棒杆菌能够生产谷氨酸，并很快被用于生产TCA循环产生的另一种氨基酸：赖氨酸，第一次获得了赖氨酸生产菌株。在发现赖氨酸生产菌后的50年内，对该菌的生理特性的了解得到很大的发展，并对工业生产菌株进行了开发和优化。目前，生物技术在生产过程中的使用，使赖氨酸的年产量大约在750000吨左右。今天，面向系统的方法，旨在研究细胞不同组成部分如转录子，磁通量子和代谢组分的联系，提供了一个新的强大的平台，将推动更全面的理解和研究赖氨酸高产微生物，得到更优越的生产菌株。

1导言

作为动物饲料添加剂，L-赖氨酸是最重要的必需氨基酸之一。动物饲料，通常是基于玉米，小麦或大麦，但是它们赖氨酸含量是非常低的。丰富的赖氨酸添加到饲料中可以更好的促进猪、鸡等畜类的生长。在此之外，直接添加赖氨酸被证明是非常有用的，它不会导致超出他们需要的其它氨基酸额外的吸收和代谢，可以避免多余的氨的形成以及在肥料中因氮含量的增加所形成的环境负担。在过去20年，全世界不同的国家持续的白肉消费量的增加，导致赖氨酸市场的急速增大（图1）。目前，全球范围的每年赖氨酸生产量为75.00万吨，预计明年产量将增长约8％。因为只有左旋异构体的赖氨酸作为饲料添加剂是有效的，所有的制造过程将采用发酵法进行生产。赖氨酸的生物技术的摇篮坐落在日本，氨基酸需求量的增加，特别是谷氨酸，大约在50年前的1956年日本出现了大量的菌种筛选程序，导致了生产谷氨酸的微生物谷氨酸棒杆菌的发现。几年之内，筛选得到了第一个生产赖氨酸的突变菌株，而且在大规模生产中得到推广应用。自那时以来，生产菌的发酵流程得到了不断的优化，导致赖氨酸的生产效率，包括生产赖氨酸所需的可再生资源，得到了很有效的提高。

图1不断发展的世界各地每年通过生物技术生产的L -赖氨酸的量

2赖氨酸合成途径

在微生物中赖氨酸的合成具有两个完全不同的路线：一个是从酮戊二酸或乙酰辅酶A开始的通过α-氨基已二酸的途径，另一个是从天冬氨酸开始的通过二氨基庚二酸的途径。其中α-氨基已二酸途径多发生在高等真菌，古细菌以及细菌中，分别由以下 5个酶：高异柠檬酸盐合成酶，高乌头酸合酶/顺高乌头

酸酶，异柠檬酸脱氢酶，α-酮戊二酸和乙酰辅酶A催化生成α-氨基已二酸，再经过α-氨基已二酸还原酶，酵母氨酸还原酶和酵母氨酸脱氢酶催化生成赖氨酸。这一途径中首次是在嗜热链球菌中发现，α-氨基已二酸转化生成赖氨酸经过乙酰中间体：N2 -乙酰-L-α-氨基已二酸，N2 -乙酰- L–氨基-δ-磷酸盐，N2 -乙酰- L–氨基半醛和N2 -乙酰- L-赖氨酸，这些中间体的编码基因分别为：lysX，lysZ，lysY，要么lysJ或argD，要么lysK或argF。

在细菌和植物中，赖氨酸是由天冬氨酸通过二氨基庚二酸途径合成的。该途径不同于常见的中间物四氢吡啶羧化酶（如图2所示），这些途径包括琥珀酰中间体，而乙酰化酶途径包括乙酰化中间体和所谓的脱氢激酶途径直接从四氢吡啶羧化酶形成DL-二氨基庚二酸。最近研究发现在衣原体中存在转氨酶途径，首先从四氢吡啶羧化酶形成LL-二氨基庚二酸，然后再转化为DL-二氨基庚二酸。大多数细菌只包括这些途径之一。但是琥珀酰途径在革兰阴性和革兰氏阳性菌中都存在，而乙酰化酶途径只在芽孢杆菌种存在。只有在少数生物中如棒状杆菌和浸麻芽孢杆菌属中两个途径是可以共存的。两个不同代谢途径的共同点在于均受到天冬氨酸激酶的反馈抑制调节。在谷氨酸棒杆菌中，天冬氨酸激酶有一个同功酶存在，它由两个基因：lysCα和lysCβ编码，这两个基因是该酶的两个亚基的编码基因。赖氨酸和苏氨酸对该酶的生化活性具有反馈抑制作用，这个酶在芽孢杆菌中存在相同的反馈抑制作用，但是却存在两种不同的同功酶。目前存在的同功酶受赖氨酸和蛋氨酸的抑制作用，但是另外一个同功酶仅仅受苏氨酸的抑制作用。此外，在有些细菌如大肠杆菌和芽孢杆菌中，酶的活性调控代谢物在赖氨酸合成途径中还具有转录调控作用。

3作为生产菌的谷氨酸棒状杆菌

谷氨酸棒状杆菌，包括其亚种黄色短杆菌亚种，乳糖短杆菌，钝齿棒状杆菌和分枝短杆菌，是赖氨酸工业生产中最重要的微生物。其他物种唯一在赖氨酸生产中使用的是重组的大肠杆菌菌株。20世纪50年代发现谷氨酸棒杆菌具有分泌氨基酸的功能是，该菌是革兰氏阳性，棒状，非活动，好氧菌（图3）。

图2二氨基庚酸途径和在原核生物中从天冬氨酸开始的赖氨酸的合成途径

：琥珀酰途径（A）;乙酰途径（B），脱氢酶途径（C），和转氨酶途径（D）

图3谷氨酸棒状杆菌 ATCC 13032电镜图

更详细的特点包括细胞壁上具有细胞壁半乳聚糖和具有26-36个碳原子组成的霉菌酸和通过中间交叉连接的胞壁质囊酸聚糖，基因组的GC含量为53.8％。进一步的生化研究，如最近的谷氨酸棒杆菌手册，它综述了过去几十年谷氨酸棒杆菌的研究和最近测序得到的基因组序列，使我们对赖氨酸的生物合成和代谢反应有了更详细的了解（图4）。

图4中央代谢途径和在谷氨酸棒状杆菌中赖氨酸的合成途径

3.1赖氨酸合成

赖氨酸属于天冬氨酸族氨基酸，在谷氨酸棒杆菌中是从丙酮酸，草酰乙酸和二个氨分子（供应生成还原型辅酶Ⅱ来增加能量）开始合成的。有趣的是，机体有一个赖氨酸合成分枝途径。这个分支途径增加了改变谷氨酸棒杆菌环境条件的复杂性，例如氨含量的改变。 DL-二氨基庚二酸作为赖氨酸途径的中间代谢物是胞壁质囊合成必不可少的组成部分。赖氨酸生物合成的调节物天冬氨酸激酶，是