裸鼠荷瘤实验

接种量
要查文献来确定接种量，在找不到任何相关资料的情况下，最高就用到1*107/0.2ml/site,再高也没有意义了。

如果你的细胞很小，1*107/0.1ml也可以操作，不至于很粘稠，那么最好是1*107/0.1ml/site。

查文献看他们的构建条件是什么样的，比如培养条件，接种量，接种位置什么的，是不是一定要用雌性鼠等等。

有的瘤株也有可能很容易成瘤，而且生长速度很快。

建议用几只动物试试不同的接种浓度，万一能够长出来，而且还长得很快，那你就要根据情况选择一个合适的浓度了。

基本上一般认为比较合适的接种浓度有这么几个特征：1. 接种后10到15天左右可以开始试验。

2. 开始试验时可以用于试验的动物数不少于60~70%，而且SD 不大于平均值的1/3左右。

3. 开始试验三、四周后肿瘤重量大于1g，并且没有溃烂。

当然，这些条件都是锦上添花的东西，如果以1*107/site 都勉勉强强长出肿瘤，那么就不必过多的去考虑它了。

接种部位
接种部位:腋窝中部外侧皮下为好。

皮下肿瘤模型中，想要成瘤率高就接种在腋下。

接种时由裸鼠体侧腰部稍靠上的部位进针，要保证与接种点的距离小于针头的长度，向头部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头到达接种位点时注射，退出针头，这样操作的目的并不完全是避免漏液，其实熟练后，不需要皮下穿行也不会漏液，主要是避免污染，进针点还有少量污染的可能性的，针头在皮下穿行一段后，接种点离进针点较远，最大限度减少污染的可能。

如果是用于正式实验，那么一只老鼠就只能接种一个位点，不可以接种多个位点用于保证可用的模型数。

因为在有些情况下，一个老鼠身上有多于一个肿瘤的情况下，会有相互影响的可能，无论这几个肿瘤相距有多远。

要是想多打几个部位做做预试验，倒也不是不可以，但是我觉得，基本上没有什么必要。

皮肤不用绷得太紧，平展就可以了，另外接种的时候进针点很靠下，针头在皮下走一段再注射，速度不要太快。

注射前针头稍微动一动，能动就说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内。

一般来说都是有鼓包的但是要是你接种位置太深入腋窝，你是看不到鼓包的。

主要靠针头稍微动一动来判断。

是否应用免疫抑制剂
裸鼠皮下种瘤后，可以通过应用免疫抑制剂，比如环磷酰胺（2mg 每只，打两天）来加速瘤体的生长，当然我知道裸鼠是T免疫缺陷动物，但是人家说的CTX可以进一步抑制裸鼠的体液免疫和NK细胞杀伤的保护作用，可以加快瘤子的生长，这样造模的周期很短，也可以进行人为的控制，不知道这个观点是不是有道理，实践中是不是真有人这么做呢？
楼上说的文献中也有报道，而且还有预先用放射照射抑制动物免疫功能再接种的方法，但是一般常规应用中大多数时候不推荐这么做。

另外还有一个问题应该被考虑到，大家现在都在琢磨着怎么让肿瘤出瘤的更快，造模周期更短，但是如果人为的把肿瘤生长加速，其实对实验并不好。

因为造模周期短，很可能生长速度也会被加快，肿
瘤可能很快就溃烂了，这样就不得不被迫中止实验，而用药却没有用到足够的时间，药效还没有发挥出来就结束了，这样是很不利的。

所以一般情况下，应该尽量的复合这个瘤株本身的生长特性，不应该过多地去加以人为的干扰。

是否用手术标本荷瘤
如果是药效试验，不建议用手术标本，因为SFDA的临床前研究指导原则上明确指出要用建株的肿瘤株进行试验，因为用手术标本的试验可重复性太差，你这个标本万一没有保存好，断掉了，你自己都很难重复出上次的试验结果。

国外的文献上看到的却很少有人用手术标本构建模型进行试验。

取材的部位：肿瘤生长活跃，状态良好，结缔组织比较少的地方。

运送途径：无菌、冰浴保温，无菌培养液浸泡，时间不能超过1个小时。

最好一个小时内就能够接种到动物体内。

接种部位：腋下。

另外，手术标本还有一个风险：你不能保证取得的标本一定能够顺利地成瘤并且用于试验。

注意事项
A裸鼠的周龄,B肿瘤细胞:何种肿瘤,接种细胞的数量(用对数生长期的,活力高的)记数要准确,C接种方式:注意不要漏液,否则会损失细胞数量D饲养环境:要求是SPF条件
具体操作
1.能不能成瘤，首先要考虑你的肿瘤细胞系能否成瘤，其次关键是你的肿瘤细胞数，一般肿瘤细胞存活力还是蛮高的，所以你重点
要考虑细胞数的问题，但最高不要超过1*107。

2.接种时间，最好在1小时之内完成。

但在我实际操作过程中，裸鼠的数量又多，1小时之内根本做不完的，所以你可以预先将细胞放在冰盒里暂为保存。

效果还是不错的。

3.成瘤时间，每个肿瘤细胞不太一样，细胞数合适，一般一周左右应该能出来了；另外，如果你是打皮下，你要考虑是否有打到深层组织，比如肌肉，那即使成瘤了，也不大好摸出来。

腹腔注射
1、腹腔注射进针的位置在腹中线与小鼠两后肢上沿连交叉以下的位置。

2、腹腔注射很少会打到肠管，因为肠子在碰到硬物时会缩起来，当然前提是你的进针不是特别深，如果你的整个针头都扎入了腹腔，那么肠子是无处可躲了。

3、腹腔注射进针后，你可以将针头左右摆动一下，如果是正确的，这时会有一种很自由无障碍的感觉，进针角度撑握在小于45度，针头进入长度不超过3厘米左右。

用大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液（图2-5），为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。

若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。

肿瘤倍增时间肿瘤动物实验模型肿瘤的倍增时间（doubli
ngtime），应该是在瘤体积100－800之间计算，但是一组动物有10只，每周测量2次瘤体积，如果我想计算从200倍增到4 00的时间的话，10只动物不会在我测量体积的时候正好到20 0或400，那么，在计算的时候，具体应该怎么做？Geddes
等[29]将结节倍增时间的计算公式表示为：DT =（ln 2△t）/ ln（V2/V1），V1、V2分别是前后两次测量的体积，△t是两次测量的时间间隔
你的问题有歧义，我觉得可以有几下几种理解：1.测量的时候，对于某个老鼠来说，第一次可能测出来的体积是189.26（不是正好200），第二次是415.31（不是正好400），对于其他的动物都有这样的问题，2.对于十只老鼠来说，测量的时候，可能1号老鼠是189.26，2号是312.57，3号是110.89......，这也是一种理解，我的意见是：测量一段比较长的时间，每只老鼠可以独立计算倍增时间，然后计算平均值，SD等，用统计学处理的手段。

个体差异同一批种几十只老鼠，有的就长不出来，有的长得很大，使评价药效很困难。

排除接种悬液未摇匀的可能后，还有什么原因可能造成这一点？可能是是个体差异了。

其中，老鼠年龄是一个很大的因素。

本人就遇到过2个月的老鼠接种肿瘤以后，有的长有的不长的情况。

如果控制好试验条件，动物也比较均一的话，一般肿瘤生长都会很好的控制在一定范围
的
肿瘤模型新药申报
zym145286做的肿瘤模型实验是用于新药申报用,现在有一些问题还不能校准,我做的是人癌模型,实验动物为裸鼠.
1. 新药报批中,有明确的要求说肿瘤来源必须是体内传代3次以上吗?
2. 实验结束后,对于取出肿瘤块的质量有没有明确的规定呢?还是跟其他种鼠一样,要求平均瘤重不小于1g或者不大于20%的瘤快质量不小于400mg,
3. 实验评价指标相对肿瘤增殖率T/C(%),指的是瘤体积比还是瘤质量比?
4. 实验申报材料是否需要附属实验动物裸鼠的照片?若需要附属的话,照片没有没有什么要求怎么照的，是鼠活的时候的照片还是实验结束后处死鼠后在摆好位置照?
5. 申报材料中附图要求是肿瘤的生长曲线还是不同时间测量的T/C值对时间所做的曲线?还是两个都要有呢?
6. 实验分组分5组,空白溶剂对照组,药物高中低三个剂量组,阳性药物有效浓度对照组. 这样可以吗?要是不可以,还需要怎么分呢?
7. 实验材料中是否需要包含该实验动物血液相关指标的数值呢?比如:白细胞数量,骨髓的影响等等
8. 一次实验有效后,是不是也需要重复实验三次?那三次的数
据都需要包含在数据中吗??
swordzjsh具体问题回答如下：1.没有问题，新老原则均明确要求体内三代以上，并且不能超过15~20代（人肿瘤）。

2. 新原则已经没有瘤重的指标，只考察瘤体积，也没有对试验结束后的肿瘤大小有明确要求，但是老的指导原则有这方面的要求。

3. 新的原则是指瘤体积，老的指瘤重，实际上在数据处理的时候一般瘤体积和瘤重的数据都会加入，分别计算相应的T/C。

4. 需要，常见的有两种：一种是处死后摆放并拍摄整鼠照片，还有一种是剥取肿瘤后拍摄肿瘤的照片，还是那句话，最好都有，至少资料中放一个，另外一份备好，答辩的时候可以随时展示。

另外，以前不允许数码拍摄，要求光学照相机，以防电脑编辑，不知道现在还有没有类似的要求。

5.有的人要看肿瘤生长曲线，有的人要看T/C的曲线，不过一般放生长曲线的多一些，记住，生长曲线现在要求RTV，相对肿瘤体积。

以前报批的时候就可以放RTV曲线了，现在更是RTV的天下。

6.一般来说，正式试验基本上就是这么设计了，但是你最好有这些剂量、疗程、给药途径等的设计依据，比如权威文献、你们的预试验等材料备问。

当然，如果你的药物有些特别的地方，那么要根据他的具体特点设计试验。

7. 这个是锦上添花的指标，对于药效试验来说，没有明确要求，但是一定要有体重和死亡的数据。

8. 老原则要求重复两次，一共三次试验，新原则前几稿要求重复一次，一共三次试验，但是最新一稿我没有看到对于重复试验的要求，但是作为药理研究的基本常识，重复试验是
一定需要的，作为正式试验的重复试验应该把数据和结果分析都列入报告中，重复试验之间是同等重要的。

zym145286:针对您的回答,我仍有几点不解1.实验结束后瘤的
质量标准问题,您说新原则没有指标,那么老原则(就是现在还遵
循的原则)具体是多少呢,能不能说明一下啊?
2. T/C标准按照体积计算的时候,按照的是哪个时间点的体积
呢,还是说整个测量过程的体积都要算?3.还有一个比较基本的
问题,不要笑话我了，呵呵,那个RTV是怎样算出来的?是用药组
数据减去空白组数据吗?还是其他算法?4.正式实验中,每组的动
物数量是多少?6只,还是10-12只?5.对给药时间有没有什么具
体要求呢,就是说有没有上限,比如不可以超过一个月啊什么的? swordzjsh1. 老原则的标准就是你写出来的那个。

2. 整个测量
过程的体积都要算，可以用T/C对时间点作图的那种。

实际上，
不知道你有没有老的指导原则，上面有一个表，那个表里面汇
总了一些试验的基本信息，那个表里面要填增殖率，一般是选
效果最好的那一天的数据填上去。

3. RTV = Vt / V0。

其中V
0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时
的肿瘤体积。

RTV是针对每一只小鼠计算的。

4. 对于裸鼠来说，
5到10只，要根据你的药物的性质来定，如果SD较大，建议
多设几只，容易做出统计差异。

如果SD较小，不少于6只，
因为要求试验过程中动物死亡率不超过20%，6只动物死了一
只还可以接受，要是5只动物死了一只就是20%了。

5. 没有
具体的要求，一般在3到5周，常见为三周，并且保证肿瘤长
到足够的大小。

如果有特别的原因可以变化试验周期，但是一
般都是加长而不会缩短。

实验分组与标记
baobaogao197759:我的实验是观察药物对lewis肺癌的生长的
影响。

1、实验分为五组（模型组、阳性对照组（CTX）药物大、中、小剂量组）。

我不清楚需不需要设置阴性对照组（就是不造
模组，）2、C57小鼠怎样标记，有剪趾、穿耳孔的方法。

但是
具体的操作没有说明，能否介绍一下。

swordzjsh1.不需要设normal组，因为肿瘤的生长和评价非常
明显，不会有干扰的可能。

2. 我一般是剪耳号，一只小鼠两只
耳朵，每只耳朵可以剪上侧和下侧两个位点，你可以自己指定
组合，比如我们是这样的：左上为一号，左下为二号，右上为
三号，右下为四号，左侧上下为五号，右侧上下为六号，左上
右上为七号，左下右下为八号.细胞悬浮液体
roger150,在做肿瘤模型用细胞接种时,细胞悬浮在什么液体里
面.有没用matrigel同细胞混匀后再接种的?
Swordzjsh:一般来说，可以悬浮在相应的无血清培养基、PBS、saline 中，接种效果以上三种次第降低。

用matrigel是一种促进肿瘤形成生长的手段，如果本身肿瘤生长不是特别困难不建议用它，但是一些比
如A549之类的细胞株，接种后五六十天还只有600~700mm3的肿瘤，就可以考虑使用matrigel。

使用matrigel的时候要注意低温操作，因为室温下mareigel就有可能固化。

一般是在冰浴中操作。

白血病肿瘤,皮下注射or静脉注射？abaiabai我的理解是，静脉注射反应的是疾病全身播散的作用，皮下注射便于观察瘤块大小，衡量用药效果，应该结合自己试验的目的选择注射方法
juanr7213我最近刚刚实验比较了一下静脉注射和皮下接种白血病细胞株，从理论上说静脉接种似乎皮下接种更接近白血病的生物行为特点，但是根据我的实验和以前的文献，静脉接种小鼠的平均生存期很短，我的不超过10天，我还试验性的进行了化疗，结果几乎全死了，而皮下接种者结果稳定。

所以选皮下还是静脉，应该根据自己的试验目的来定，长期的实验好像不太适合用静脉注射的方法。

swordzjsh皮下或者静脉注射都可以，看你的细胞株了，也有用腹腔注射的。

小鼠的捉拿从笼盒内将小鼠尾部捉住并提起，放在笼盖（或表面粗糙的物体）上，轻轻向后拉鼠尾，在小鼠向前挣脱时，用左手拇指和食指抓住两耳和颈部皮肤，无名指、小指和手掌心夹住背部皮肤和尾部，并调整好动物在手中的姿势。

这类捉拿方法多用于灌胃以及肌肉、腹腔和皮下注射等。

如若进行心脏采血、解剖、外科手术等实验时，就必须要固定小鼠。

使小鼠呈仰卧位（必要时先进行麻醉），用橡皮筋将小鼠固定在小鼠实验板上。

如若不麻醉，则将小鼠放人保定架里，
固定好保定架的封口。

小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。

通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。

在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。

如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。

实验动物的编号
编号的方法很多，根据动物的种类数量和观察时间长短等因素来选择合适的标记方法。

(一)挂牌法：将号码烙压在圆形或方形金属牌上(最好用铝或不锈钢的,它可长期使用不生锈),或将号码按实验分组编号烙在栓动物颈部的皮带上，将此颈圈固定在动物颈部。

该法适用于狗等大型动物。

(二)打号法：用刺数钳(又称耳号钳)将号码打在动物耳朵上。

打号前用蘸有酒精的棉球擦净耳朵，用耳号钳刺上号码，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。

该法适用于耳朵比较大的兔、狗等动物。

(三)针刺法：用七号或八号针头蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等处刺入皮下，在受刺部位留有一黑色标记。

该法适用于大小鼠、豚鼠等。

在实验动物数量少的情况下，也可用于兔、狗等动物。

(四)化学药品涂染动物被毛法：经常应用的涂染化学药品有涂染红色：0.5％中性红或品红溶液。

涂染黄色：3-5％苦味酸溶液。

涂染黑色：煤焦油的酒精溶液。

根据实验分组编号的需要，可用一种化学药品涂染实验动物动物背部被毛就可以。

如果实验动物数量较多，则可以选择两种染料。

该方法对于实验周期短的实验动物较合适，时间长了染料易退掉；对于哺乳期的子畜也不适合，因母畜容易咬死子畜或把染料舔掉。

(五)剪毛法：该法适用于大、中型动物，如狗、兔等。

方法是用剪毛刀在动物一侧或背部剪出号码，此法编号清楚可靠，但只适于短期观察。

(六)打孔或剪缺口法：可用打孔机在兔耳一定位置打一小孔来表示一定的号码。

如用剪子剪缺口,应在剪后用滑石粉捻一下,以免愈合后看不出来。

该法可以编至1～9999号，此种方法常在饲养大量动物时作为终身号采用。

实验动物的分组
(一)分组的原则：进行动物实验时，经常需要将选择好的实验动物按研究的需要分成若干组。

动物分组应按随机分配的原则，使每只动物都有同等机会被分配到各个实验组与对照组中去，以避免各组之间的差别,影响实验结果，特别是进行准确的统计检验,必须在随机分组的基础上进行。

每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求而定。

如果是慢性实验或需要定期处死动物进行检验的实验，就要求选较多的动物，以补足动物自然死亡和认为处死所丧失的数量，确保实验结束时有合乎统计学要求的动物数量存在。

(二)建立对照组：分组时应建立对照组。

1.自身对照组：是指实验数
据而言。

实验动物本身在实验处理前、后两个阶段的各项相关数据就分别是对照组和实验组的实验结果，此法可排除生物间的个体差异。

2.平行对照组：有正对照组和负对照组两种。

给实验组动物某种处理，而给正对照组用同样方法进行处理，但并不采用实验所要求的药物或手段，负对照组则不给任何处理。

3.具体分组时，应避免人为因素, 随机把所有的动物进行编号，然后令其双数为Ａ组(实验组),单数为B 组(对照组)即可或反之。

如果要分若干个组时，应该用随机数字表示进行完全随机分组。

动物采血采血方法的选择，决定于实验的目的所需血量以及动物种类。

凡用血量较少的检验如红、白细胞计数、血红蛋白的测定，血液涂片以及酶活性微量分析法等，可刺破组织取毛细血管的血。

当需血量较多时可作静脉采血。

静脉采血时，若需反复多次，应自远离心脏端开始，以免发生栓塞而影响整条静脉。

例如，研究毒物对肺功能的影响、血液酸碱平衡、水盐代谢紊乱，需要比较动、动脉血氧分压、二氧化碳分压和血液pH值以及K+、Na+、CI-离子浓度，必须采取动脉血液。

采血时要注意：⑴采血场所有充足的光线；室温夏季最好保持在25-28℃，冬季，15-20℃为宜；⑵采血用具有采用部位一般需要进行消毒；⑶采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥；⑷若需抗凝全血，在注射器或试管内需预先加入抗凝剂.
采动物品种最大安全采血量(ml) 最小致死采血量(ml)
小鼠0.2 0.3
小鼠采血方法
1.割(剪)尾采血当所需血量很少时采用本法。

固定动物并露出鼠尾。

将尾部毛剪去后消毒，然后浸在45℃左右的温水中数分钟，使尾部血管充盈。

再将尾擦干，用锐器(刀或剪刀)割去尾尖0.3-0.5cm，让血液自由滴入盛器或用血红蛋白吸管吸取，采血结束，伤口消毒并压迫止血。

也可在尾部作一横切口，割破尾动脉或静脉，收集血液的方法同上。

每鼠一般可采血10余次以上。

小鼠每次可取血0.1ml，大鼠0.3～0.5ml。

2.鼠尾刺血法大鼠用血量不多时(仅做白细胞计数或血红蛋白检查)，可采用本法。

先将鼠尾用温水擦拭，再用酒精消毒和擦拭，使鼠尾充血。

用7号或8号注射针头，刺入鼠尾静脉，拔出针头时即有血滴出，一次可采集10～50mm3。

如果长期反复取血，应先靠近鼠尾末端穿刺，以后再逐渐向近心端穿刺。

3.眼眶静脉丛采血采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。

当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。

右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。

刺入浓度，小鼠约2～3mm，大鼠约4～5mm。

当感到有阻力时即停止推进，同
时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。

若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。

若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。

左右两眼轮换更好。

体重20-25g的小鼠每次可采血0.2-0.3ml；体重200-300g大鼠每次可采血0.5-1.0ml，可适用于某些生物化学项目的检验。

4.断头取血采血者的左手拇指和食指以背部较紧地握住大(小)鼠的颈部皮肤，并作动物头朝下倾的姿势。

右手用剪刀猛剪鼠颈，约1/2-4/5的颈部前剪断，让血自由滴入盛器。

小鼠可采用约0.8～1.2ml;大鼠约5-10ml。

5.心脏采血鼠类的心脏较小，且心率较快，心脏采血比较困难，故少用。

活体采血方法与豚鼠相同。

若做开胸一次死亡采血，先将动物作深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液。

小鼠约0.5-0.6ml；大鼠约0.8-1.2ml。

6.颈动静脉采血先将动物仰位固定，切开颈部皮肤，分离皮下结缔组织，使颈静脉充分暴露，可用注射器吸出血液。

在气管两侧分离出颈动脉，离心端结扎，向心端剪口将血滴入试管内。

7.腹主动脉采血最好先将动物麻醉，仰卧固定在手术架上，从腹正中线皮肤切开腹腔，使腹主动脉清楚暴露。

用注射器吸出血液，防止溶血。

或用无齿镊子剥离结缔组织，夹住动脉近心端，用尖头手术剪刀，剪断动脉，使血液喷入盛器。

8.股动(静)脉采血先由助手握住动物，采血者左手拉直动物下肢，使静脉充盈。

或者以搏动为指标，右手用注射器刺入血管。

体重15-20g。