4、(柴海毅)微生物检验方法适用性试验

2、阳性对照
- 与可接受的标准不符 结论：重新试验
3、阳性菌计数
- 与标准不符 结论：重新开设大肠杆菌的恢复试验，制作 新的菌悬液直到符合规定。
优化控制菌验证步骤

扩大增菌液的体积
100ml 200ml 300ml 400ml 500ml

延长增菌液的培养时间 采用薄膜过滤法
加入活性试剂


检验法适用性试验（薄膜过滤法）
1、试验组和供试品对照组测试结果一致，表明：
- 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。
2、供试品对照组和菌液对照组测试结果一致，表明：
- 中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。
3、空白样品组测试结果阴性，表明：
- 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。
样品 100ml增菌液 大肠杆菌悬液 0.1ml、 1X102 cfu/ml
蛋白胨 样品组 对照
菌悬液 对照 （计数）
空白样 品对照
培
养
检验法适用性试验（平板法）
（以大肠杆菌为例）
确认
4组 测试样品
18小时
观 察
CP法
24小时
USP法

培养结束后，需检查大肠杆菌菌落形态并镜检， 必要时要鉴别。
结果判断依据
方法适用性试验内容
（一）计数法适用性试验
（二）控制菌检验法适用性试验
微生物检验法适用性试验
（一）
计数法适用性试验
供试液制备
表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效



性及对微生物的生长和存活无影响。 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过 1小时。 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过 45℃。 供试液的体积：100ml。
- 中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。
3、空白样品组测试结果阴性，表明：
- 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。
可以接受的标准 — 平板法
1、重现性良好 - 三批不同批次的样品/产品 - 三名不同的微生物检验人员 2、验证数据合理有效（微生物的回收率） - 阴性对照：无污染事件发生 - 样品组（ 回收率）： 50～200% 3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符
增菌培养基的确定

增菌培养基的实际用量等同控制菌检查 法验证时的用量。 验证的开始。

检验法适用性试验

选定一个方法：CP或USP 设定检测限：不得检出


设计检验方法适用性试验方案
检验法适用性试验（平板法）
（以大肠杆菌为例）

增菌
100ml 增菌液 蛋白胨 0.1ml、 1X102 cfu/ml 大肠杆菌悬液 0.1ml、 1X102 cfu/ml 样品组
检验方法
检验规程
SOP
影响微生物检验的因素
微生物检验的检出率很低下

样品/药品自身的特殊性 样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂 培养基的特性 培养条件 人员因素 实验器材的选择
恢复试验
微生物方法适用性试验的实质就是评价
和考察微生物恢复试验（恢复生长）的 可信度。

恢复试验就是确认某一检验方法，它可 以使加入其中的各种微生物都能够恢复 生长。
1105 非无菌产品微生物检验方法 适用性试验
柴海毅
为什么要做方法适用性试验？
与国际通用要求接轨 促进微生物检验定量化 推进微生物检验标准化 提升药品质量的要求

培养基适用性检查

范围： - 成品培养基（新引入概念） - 由脱水培养基制成的培养基 - 按处方配制的培养基
计数方法适用性试验：
计数A

供试品对照组：
样品溶液（1/10）9.9ml
稀释液 0.1 ml（阴性对照）
计数B

菌液对照组：
104 空白样品组： 102
计数C
计数D
（阳性对照）
结果判断依据
1、试验组和供试品对照组微生物计数结果吻合，表明：
- 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。
2、供试品对照组和菌液对照组微生物计数结果吻合，表明：

实质：微生物计数方法验证。

几个数字要求： - 接种菌悬液的体积不大于供试液的1% - 菌悬液含菌量不大于100cfu - 抗菌或抑菌活性的标准：回收率低于50%
微生物测试方法

平皿法
1、倾注发； 2、涂布法

薄膜过滤法 MPN法

涂布法

新引入的方法 关键点：涂布供试液不少于0.1mL.

非无菌产品微生物限度检查： 控制菌检查法
不可以接受的标准（2） 3、试验组：
- 三人三次的试验结果应该与检测限相符。 - 第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的 试验证实。 - 任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程 有缺陷，验证需重新进行。
优化更新步骤：

消除抑菌活性。

稀释样品时，应确认检测限（检验限度） 低于或等于标准。 不同的细菌，一个好的结果可以从不同的 稀释度中检测出，最高的稀释度将被用于 日常的监测中。
过滤
计数B （阴性对照）

菌液对照组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤 过滤
计数C （阳性对照）
空白样品组：
计数D
可以接受的标准 — 薄膜过滤法
1、重现性良好
- 三批不同批次的样品/产品 - 三名不同的微生物检验人员
2、验证数据合理有效（微生物的回收率）
- 阴性对照：没有污染事件发生。 - 样品组： 50～200%
如何消抑菌活性


稀释法 中和法 薄膜过滤法 组合运用
中国药典2015年版四部
样品本底含菌量高， 怎么处理？
样品本底含菌量高
1、稀释：供试液梯度稀释
Fra Baidu bibliotek2、过滤：0.45 μm滤膜过滤
中国药典2015年版四部
计数法适用性试验（平板法）

试验组：
样品溶液（1/10）9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
可以接受的标准
1、样品检验
- 增菌液经培养后明显浑浊 - 分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落
2、阳性对照
- 增菌液经培养后必须是浑浊的 - 分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落
3、阳性菌计数
- 菌悬液的计数结果应该 < 25 cfu/ml
不可以接受的标准 （无效试验） 1、样品检验
- 与可接受的标准不符 结论：重新设计试验步骤
问题？
谢 谢
2016.04.15
（以大肠杆菌为例）

加10ml 稀释液到薄膜过滤器中，加湿过滤器。 加100ml 样品增菌液到薄膜过滤器中。 加0.1ml、5X102 cfu/ml大肠杆菌悬液到薄膜过滤 器中并用稀释液冲洗，这样，薄膜上就应该有50 cfu个菌落出现。


失败的试验 （无效试验）
1、样品中有些成分是固有的抑菌成分 2、参考防腐剂的实验/验证数据
中国药典2015年版四部
中国药典2015年版四部
中国药典2015年版四部
不可以接受的标准（1） 1、阴性对照：
阴性对照(包括供试品组和空白样品组) 发生污染事件。 菌落鉴别：- 污染菌是测试菌：检验员无菌操作培训。 - 污染菌不是测试菌：偏差调查。
2、阳性对照：
样品组的试验数据与检测限不符。（微生物的回收率过 高或过低）结论：样品组的试验结果无效。 重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。
稀释剂：
（1）0.1%无菌蛋白胨水溶液
（2）pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
（3）0.9%无菌氯化钠溶液

固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml
计数法适用性检查菌种选择原则


普遍性 - G+、 G-、 -杆菌（长、短杆菌） -球菌 -真菌（丝状真菌、酵母菌） 特殊性 - 从环境中分离出来的常见杂菌 - 从样品中分离出来的常见杂菌
计数法验证用菌株：
菌株名称
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 白色年珠菌(Candida albicans) 黑曲霉菌(Aspergillus niger)
CMCC编号
计数法的验证-各国药典结果判断标准

美国药典USP36规定微生物法验证中回收率： For solid media, growth obtained must not differ by a factor greater than 2 from the calculated value for a standardized inoculum。 对于固体培养基，获得的生长结果不得超过 由标准接种而来的计算值的两倍范围。
培养基适用性检查

培养基促生长能力检查
分离培养基在规定的最短时间内促生长能力考察。

培养基抑菌能力检查
分离培养基在规定的最长时间内的抑菌能力考察。
检验方法适用性试验

实质：控制菌检验方法验证。
适用性试验：
规定最短时间培养，试验菌检出能力试验。

供试品检查

规定最长时间下的控制菌试验。
验证目的
3、样品的处理方法和检验方法与检 验规程相符
薄膜过滤法优化更新方法

增加冲洗量
增大样品稀释倍数（1/50，1/100） 延长培养时间
添加抗活性剂（冲洗剂里加也可以）


微生物检验法适用性试验
（二）
控制菌检验法适用性试验
检验法适用性试验菌种选择原则

样品的给药途径和类型决定了采用何种 控制菌实施检验方法适用性试验。


设计适用性检查方案
样品的选择

合格的样品
（1） 按照正常取样方法取样的样品 （2） 符合限度标准的样品
检测限：样品中细菌被检出的最低量。
平板法：

细菌 ≤ 300 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 ≤ 100 cfu/ml
薄膜过滤法：

细菌 ≤ 50 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 ≤ 50 cfu/ml

- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法， 如果样品（药品）中有一定数量的微生物 存在，那么采用此法可以使得样品（药品 ）中的微生物得以检出。 - 充分验证样品（药品）本身对微生物生长 的影响。

方法适用性试验的目的

确认一种检验方法。
验证实验
检验条件
样品量 稀释液种类 稀释液体积 中和剂 培养基 培养时间 培养温度 ……
检测限设定依据

微生物计数原则 限度 / 标准


数理统计方法学的要求
恢复试验

恢复生长是指人为地添加的测试菌（污 染菌）在供试液中的生长水平

回收率则是测试菌（污染菌）在样品供 试液中的存活率与测试菌污染菌的检出 率的比值
恢复试验的原则

消除样品的抑菌性

样品的处理方法和检验方法不应影响样 品中微生物的生长
3、参考样品中各成分的理化性质
适用性试验结果

根据适用性试验结果，判断是否符合培养基适 用性标准。 - 符合：
按适用性方法和条件继续进行药品的微生物
限度检查；
- 不符合：
重新设计适用性试验方案，再进行试验，直
至适用性试验结果全部符合预定方案。
适用性试验报告的形成
1、全部适用性试验工作必须按照批准的适用 性试验进行。 2、适用性试验方案批准后，可以进一步再修 订，但必须在验证报告上注明。 3、适用性试验结束后，应该同时出具验证数 据记录和适用性试验报告。 4、最终样品稀释度及方法必须在SOP中 说明。
CMCC(B)10104 CMCC(B)26003 CMCC(B)63501 CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
培养条件
TSA培养基 30-35℃ 不超过3天
① TSA培养基 30-35℃ 不超过5天 ② SDA培养基 20-25℃ 不超过5天
计数法适用性检查步骤

选定一个方法 确定检测限

平板法优化更新方法

稀释样品：1/10
1/50
1/100

增加培养基量 延长培养时间
添加抗活性剂


计数法适用性试验（薄膜过滤法）

试验组：
样品溶液（1/10）10ml 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
计数A

供试品对照组：
蛋白胨稀释液 10ml 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml