蛋白质定量研究技术方法及差异表达蛋白质作用通路分析(1)

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LTQ-Orbitrap
• Orbitrap：分辨率很高
• LTQ：灵敏度和采集频率高
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小结
定量方法
常用质量 分析器
分辨率 采集频率 灵敏度
iTRAQ TOF/TOF 中
高
中
SILAC SRM 无标记
LTQOrbitrap
QQQ
LTQOrbitrap
低-高 低
低-高
高-低 高
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蛋白鉴定通常由于样品的高复杂度以及动态范围，低丰度的蛋白的 信号常夹在在高丰度蛋白的信号里，被后者掩盖。而有时候恰恰是 那些没能检测到低丰度蛋白具有关键意义。这种现象在临床体液样 品（如血清、脑脊液、羊膜液等）中尤其明显。
问题： 怎样让那些低丰度蛋白得到检测？ 困难：
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MALDI-TOF
• 单个样品准备时间短，采集速率较快，
分辨率适中（50 ppm）
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质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)
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质谱的分类
• 质谱可以根据其离子源和质量分析器的类 型进行分类
• 根据离子源：电喷雾质谱，MALDI质谱等
• 根据质量分析器：飞行时间质谱、离子阱 质谱等
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质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)
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SRM
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SRM: MS Western
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母离子/碎片离子对的验证
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SRM: MS Western
关键步骤？
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open square, galactose; closed square, N-acetylglucosamine; open triangle, fucose; closed triangle, N-acetyl-neuraminic acid; closed circle, mannose.
• 基于凝胶电泳
• 基于质谱
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荧光差异电泳技术及应用案例
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荧光差异电泳技术及应用案例
Biblioteka Baidu
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荧光差异电泳技术及应用案例
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基于质谱的定量蛋白组学技术
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多级质谱
• 一级质谱中，我们假定每个峰代表完整的肽段
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如果加大上样量，则高丰度蛋白含量同比例增加，信号掩盖效应 依然存在。
应对策略：
选择性去除高丰度蛋白，即富集低丰度蛋白。
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SRM (selected reaction monitoring), IUPAC name MRM (multiple reaction monitoring)
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance, FTICR) • Orbitrap
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Orbitrap
• 分辨率很高，采集频率适中
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质谱的分类
• 常用的质谱均含有多个质量分析器，比如： • TOF/TOF • QQQ • Q-TOF • Q-Trap • LTQ-Orbitrap • 此外还有多种其他组合，各有优缺点，分
别适合不同的定量方法
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高-低
高-中 中
高-中
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目前常用定量蛋白组学技术
• 常用定量蛋白组学技术概述 • 荧光差异电泳技术及应用案例 • SILAC技术及应用案例 • 等质量标签技术及应用案例 • SRM技术及应用案例 • Label-free技术及应用案例
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常用定量蛋白组学技术概述
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
基于质谱的定量蛋白组学技术
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iTRAQ标记试剂的结构
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance, FTICR) • Orbitrap
问题：
小鼠血红细胞中Kindlin-3敲除，在蛋白表达方面，能引起什么样的下 游变化？
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1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功能 的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance, FTICR) • Orbitrap
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance, FTICR) • Orbitrap
问题： Trx1的靶标蛋白有哪些？
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蛋白鉴定通常由于样品的高复杂度以及动态范围，低丰度的蛋白的 信号常夹在在高丰度蛋白的信号里，被后者掩盖。而有时候恰恰是 那些没能检测到低丰度蛋白具有关键意义。这种现象在临床体液样 品（如血清、脑脊液、羊膜液等）中尤其明显。
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近来在整合素介导的细胞粘着复合物种新发现了三个ILK结合蛋白家 族的蛋白，其突变可导致Kindler综合征（主要症状为水疱、大疱，伴 光敏感，逐渐出现全身皮肤异色），于是将这些蛋白称为Kindlin-1~3。
在小鼠模型中，Kindlin-3基因失活可引起重度贫血，其原因猜测是血 小板整合素激活机制的缺陷，导致血小板聚集缺陷以及血栓的生成。
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Quadropule
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Quadropule
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Quadropule
• 三重四级杆，用于SRM定量
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质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)
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SILAC
(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)
• 质量控制：必须达到一定的掺入率(95%)。？
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Promote Flag-H3.1 expression
• 缺陷： 必须是能传代的细胞。？
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance, FTICR) • Orbitrap
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MALDI
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MALDI
• 需要经过铺基质、点靶板等步骤，通量较低 • 一般只产生+1价离子
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质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)
蛋白质定量研究技术方法及 差异表达蛋白质作用通路分析
10/24/2011
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内容纲要
• 质谱（Mass spectrometer）工作原理及蛋白 质组学中常用质谱类型
• 目前常用定量蛋白组学研究手段
• 差异表达蛋白的生物信息学分析
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质谱工作原理
• 质谱的工作原理 • 质谱的分类 • 蛋白质组学中常用质谱类型及各自特点
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance, FTICR) • Orbitrap
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TOF
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TOF
• 肽段分子量1000 Da，MALDI离子化成+1价 离子，静止时施以15 kV电压，飞行距离1.5 m，飞行时间是？
• 时间很短，因此测量相对误差容易较大
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MALDI-TOF
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MALDI-TOF
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iTRAQ 8-plex
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二级质谱谱图示意
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二级质谱谱图实例
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Molecular & Cellular Proteomics 8:1674–1687, 2009.
Trx1催化二硫键和S-亚硝基 化的还原。Trx1仅通过蛋白 -蛋白相互作用方式选择性 地还原蛋白。
• 根据质量分析器：
• 飞行时间 (time of flight, TOF) • 四级杆(quadruople， Q) • 离子阱(ion trap, IT) • 傅里叶离子共回旋(Fourier Transform ion cyclotron resonance, FTICR) • Orbitrap
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质谱基本构造
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质谱基本构造
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最早的质谱（复制品）
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质荷比的测定原理
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小结
• 质谱仪的功能是测定离子的质荷比。
• 质谱仪一般包括三个主要部分：离子源、 质量分析器和检测器。
• 下一部分：质谱的类型
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ESI
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ESI
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ESI
• 直接从溶液中将生成离子化喷雾
• 同一肽段可以产生带有不同电荷的一系列离子
（2+~7+）
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质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)
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Ion trap
• 灵敏度高，采集频率高，
• 缺陷：1/3 rule
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质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)
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FTICR
• 根据磁场中的离子回旋频率来测量离子质荷比
• 分辨率很高，采集频率低
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质谱的分类
• 根据离子源：
• 电喷雾(electrospray ionization, ESI) • 基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)