第9章 微生物与基因工程03

粒载体才有利于基因的克隆和重组子的筛选？
五、噬菌粒载体
（参见P276）
丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点。
三、其它
DNA聚合酶： 碱性磷酸脂酶：
从大肠杆菌中提取，用于体外合成DNA 用于DNA连接时对载体的某段末端进行 修饰，以减少载体的自身环化
核酸外切酶：
用于DNA的缺失分析
单链核酸内切酶：
用于修饰粘性末端及进行DNA结构分析
第三节 微生物与克隆载体
以扩增外源DNA为目的载体----克隆载体（cloning vector） 作为克隆载体的基本要求（P273第一段）： （1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制 （2）载体应具有若干限制酶的单一切割位点，便于 外源DNA的插入 （3）载体必须具有可供选择的遗传标记
细胞培养费用昂贵、难于操作；
克隆基因的表达水平极低；
现在已开发昆虫细胞系作为一种昆虫DNA病毒（杆状病 毒）载体的克隆宿主，较易进行大规模的细胞培养。
四、外源DNA导如入宿主细胞 五、基因文库与cDNA文库的构建 六、重组体的筛选与鉴定
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第五节 基因工程的常用技术和方法 一、PCR的原理和应用
（4）载体DNA须易于自主复制和操作
基因工程的常用载体：
质粒载体
√
λ噬菌体载体
√
噬菌粒载体
真核细胞的克隆载体 人工染色体
柯斯质粒载体
M13噬菌体载体
一、质粒克隆载体
特点：
（参见P274 ~ 275）
a）低分子量有利于DNA的分离和操作；
b）具有较高拷贝数；
c）易于导入细胞； d）具有安全性；
质粒载体克隆外源DNA片段的大小一般不超过15Kb
• （参见P277最后一段）
变性： 92.5 ℃使待扩增模板DNA双
链间的氢链断裂形成两条单链
退火：降低温度（55 ℃）， 使引物
在低温下与模板DNA片段按碱基配对 原则特异性结合，形成部分双链
延伸 ：温度升高至(70 ℃)，
耐热Taq DNA聚合酶以单链 DNA为模板，以4种三磷酸脱 氧核苷酸(dNTP)为原料，在引 物的引导下催化合成互补的 DNA，即引物的延伸阶段。
二、DNA连接酶（DNA ligase） （参见P266）
T4 DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶
在体外将目的基因和载体共价连接构成
重组DNA分子
常用的几种体外DNA连接方法：
a）连接具有互补粘性末端的DNA片段； b）连接具有平末端的DNA片段； c）先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性 末端，然后再行连接。 d）将粘性末端补平或修平（用单链酶，如绿豆芽核酸 酶）连接
HpaI的识别序列：
5` - G T T A A C - 3` 3` - C A A T T G - 5`
5` - G T T 3` - C A A
A A C - 3` T T G - 5`
切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段：
限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段 没有突出的单链。
特点(P275第四段)：
1）分子遗传学背景清楚； 2）容量较大（能容纳大约23kb的外源DNA片段）； 3）感染效率高。其感染宿主细胞的效率几乎可达100％， 而质 粒DNA的转化率却只有0.1％。
4）具有更为狭窄的寄主范围，更加安全。
与溶原性相关的基因可以被外源DNA取代而不影响
λ噬菌体的感染、复制和裂解宿主细胞的能力。
1．原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
（参见P277）
特点：在体外模拟细胞内进行的DNA复制过程
1985 → 1993
• 基本原理：
• 以待扩增的DNA为模板，由分别与待扩增DNA两侧互补的两段寡核苷酸 作引物，在DNA聚合酶和4种dNTP存在情况下，经变性、退火和延 伸，多次循环反复使微量的特异模板DNA片段得到大量扩增。
第二节 微生物与基因工程工具酶
基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的
（P280倒数第一段）
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition enzyme）。
中分离 ，1988年萨奇（R.K.SaiKi））
3）pfu DNA聚合酶（火球菌（Pyrococcus Furiosus）
中分离）
4）Vent DNA聚合酶（Thermococcus litoralis）
（参见P279）
本章其它有关内容
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第9章思考题
1）基因工程的基本步骤是怎样的？其中哪些需涉及 到微生物的参与？ 2）为什么说微生物学不仅为基因工程提供了理论基 础，同时也提供了操作技术？ 3）一个质粒载体需要哪些基本的遗传学元件？请通过 查阅文献举例（除了书上列的pBR322外）怎样的质
第九章 微生物与基因工程
（参见P264）
基因工程（genetic engineering）或重组DNA技术
(recombinant DNA technology)
对遗传信息的分子操作和施工：
对分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导
入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，
或者令生物表现出新的性状。 （P264第一段）
（克隆载体的基本要求，了解目前有哪些克隆载体得到应用，它们各 有什么特点和联系（异同点）。重点掌握质粒和λ噬菌体克隆载体）
第四节 微生物作为克隆载体的宿主 第五节 基因工程的常用技术和方法
（PCR技术的原理与方法）
（为什么微生物通常能成为基因工程的重要宿主，最常用的有哪些）
（参见P265）
第一节 基因工程概述
二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了 生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。
微生物在Fra Baidu bibliotek因工程的兴起和发展过程中起着 不可替代的作用！
“微生物与基因工程”
第一节 基因工程概述
（微生物学与基因工程的关系）
第二节 微生物与基因工程工具酶 第三节 微生物与克隆载体
（限制性内切酶的基本概念，及其在基因操作技术中的最基本应用）
4. 同尾酶 (Isocaudomers)
有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同， 但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。 但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重 组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。
MunI： 5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5`
三、微生物学与基因工程的关系
1）克隆载体：质粒、病毒、噬菌体； 2）工具酶； 3）人工转化方法（在微生物自然转化现象的基础上发展起来的）； 4）基因克隆的重要宿主， 5）基因产物的重要表达载体； 6）理论基础（主要来自对微生物的研究）； 7）丰富而独特的基因资源；
微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术。
一、基因工程的基本过程
切——接——转——增——检
二、基因工程的发展历史
对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术 都与微生物学的发展密切相关：
DNA的特异切割
DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）
DNA的快速测序 DNA合成技术
聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增） DNA的定位诱变技术
（P281第二段）
在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修 饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化 酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。 （P281第二段）
1. 命名与分类 取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三 个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同 一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。
1）大肠杆菌：
几乎所有的有关重组DNA的研究工作均利用大肠杆菌 作为克隆基因的宿主 不利之处：
a）条件致病菌，故存在潜在的致病性，即使非致病的菌株 仍能产生内毒素，有可能污染表达产物。
b）外源基因的表达产物，易被蛋白水解酶降解或不能正确 加工折叠。
2）枯草芽孢杆菌：
不存在潜在致病性，不产生内毒素，可将蛋白质分泌 到培养基中，并且已有合适的质粒载体用于转化。

经过体外基因操作和包装后形成 途径进 入宿主细胞；
重组噬菌体，可以通过正常的感染
重组噬菌体DNA也可不经过
体外包装 而直接通过转染 方式进入宿主细胞；
质粒和噬菌体载体都可用于 构建基因文库；
但后者更有优势：
容纳的外源DNA片段较大； 以感染途径进入宿主细胞的 效率比转化高；
第四节 微生物作为克隆载体的宿主
5`-A 3`-T T C G A
A G C T T-3` A-5`
切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段： 限制性酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割 结果形成5 或3单链突出的粘性末端的DNA限制片段。 二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通过碱基 的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来。
1
根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为 I、II、III三种类型
2. 限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列通常由4～8个碱基对组成，具有二重旋转对 称轴，序列呈回文结构（palindromic structure）。
所有限制酶切割DNA后，均产生含5磷酸基和3羟基的末端
5`-A A G C T T-3` Hind III的识别序列： 3`-T T C G A A-5`
具有平末端的DNA片段也可以在DNA连接酶的 作用连接起来
3. 同裂酶（Isoschizomers） 有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类
限制酶称为同裂酶。
同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到 的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的 限制酶所切割。 同裂酶的反应条件可能存在差异。
EcoRI： 5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5`
5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5`
5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5`
重新连接后的序列：
5` - C A A T T C - 3` 3` - G T T A A G - 5`
（参见P278）
变性、退 火和延伸三个 基本步骤组成 一轮循环。 每一轮循环 将使样品中的 模板DNA扩增 一倍，经过2535轮循环后就 可使DNA扩增 107~1010倍。
（参见P278）
PCR技术的关键酶------耐热DNA聚合酶
1）Klenow聚合酶（大肠杆菌DNA聚合酶片段）
2）Taq DNA聚合酶（水生栖热菌（Thermus aquaticus）
1
四、重要的大肠杆菌质粒载体
i
pBR322
pBR322
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pBR322
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pBR322
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1 1Puc18/19 1
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5-溴-4-氯靛蓝
1
二、λ噬菌体克隆载体
（参见P275）
将野生型λ噬菌体DNA进行改造后建成，主要是去掉噬菌
体DNA上过多的常用限制酶的酶切位点，及对非必要基因区 域进行改造。
不足之处：质粒往往不稳定
3）酿酒酵母：
基因的表达调控以及蛋白质的翻译后加工比较接近高等 真核生物； 具有较高的安全性，用它表达生物药物时，不需进行 大量宿主安全试验。
对于高等真核生物基因组及其转录、翻译系统研究 提供了一个良好基础。
4）动物细胞：
有关人类遗传学、肿瘤、感染性疾病和生理学的许多 研究均需在动物细胞特别是哺乳动物细胞中进行。
一、宿主的基本要求与性质
①高效吸收外源DNA；
②外源DNA高效复制； ③无限制修饰系统； ④重组缺陷型（RecA-）； ⑤便于进行基因操作、筛选和大量繁殖； ⑥安全，对人、畜、农作物无害或无致病性；
（参见P283）
二、常用的基因工程宿主
1）大肠杆菌 2）枯草芽孢杆菌 3）酿酒酵母
4）动物细胞
特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中 生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚