微生物诱变育种ppt课件
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微生物诱变育种
理想的工业生产菌种必须具备： 1. 遗传性状稳定 2. 纯净无污染 3. 繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物 4. 能诱变产生遗传性变异 5. 具有产量高、收得率高
第一节 诱变育种的步骤
• 出发菌株的选择
• 单孢子（单细胞）悬液的制备
• 诱变剂及诱变剂量的选择 • 诱变处理方法 • 高产菌株的分离
2. 最佳剂量的选择： 经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株， 宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理。
要筛选具有特殊性状的菌株、较大幅度提高产量的菌株， 则用强诱变剂和高剂量处理。
对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处 理。对多核细胞菌株，用高剂量处理。
四、诱变处理方式
诱变处理方式： 单因子处理：是采用单一诱变剂处理（一般突变率低） 复合因子处理：是指采用两种以上诱变因素处理（突变率高） 分下列几种情况：
连续诱变育种过程中如何选择出发菌株? 突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提 高发酵水平不太容易。 在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上 改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过 一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加
灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系
一、出发菌株
对出发菌株的要求： 1. 对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高 2. 具有一定生产能力 3. 具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子 早而多的菌株
4. 有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。 5. 采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变 剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。 6. 在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积 少量所需产物或其前体的菌株; 而在选择产抗生素的出发 菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都 有一定程度提高的菌株作为出发菌株。
3. 制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理 时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化 而影响诱变效果。
三、诱变剂及诱变剂量的选择
1. 诱变剂种类选择
对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突 变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂。
对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂。 对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可 能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。
青霉素法的原理为：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类， 而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完 整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感， 因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细 菌。 制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇， 引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集 营养缺陷型菌株的作用。
1. 两个以上因子同时处理
2. 不同诱变剂交替处理 3. 同一诱变剂连续重复使用 4. 紫外线光复活交替处理
五、突变体的分离和筛选
随机突变，定向筛选。 筛选的条件决定了选育的方向，设计一个好的筛 选方案是诱变育种的重要前提。
出发菌株
诱变
绝大多数个体死亡 多数未变 多数负变
少数存活 少数突变 少数正变 少数变幅大
挑菌落
初筛 1瓶/株
挑50株复筛
3-5株（提供第三代诱变出发菌株）
简便筛选程序
第一代：出发菌株
诱变
分离到平皿上 打琼脂块挑菌落1000-3000 块
置于检定板上
挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落
初筛
Hale Waihona Puke 选30-50个菌株复筛
选3-5株（提供第二代诱变出发菌株）
第二代：出发菌株4株
诱变
分离到平皿上 打琼脂块挑菌落1000-3000 块
存活率
突变率
正变率
多数变幅小
高产率
多数不宜投产
少数宜投产
投产率
常规筛选程序：
第一代：出发菌株
诱变
分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）
挑选菌落 200个
初筛 1瓶/株
50株复筛
3-5株（提供第二代诱变出发菌株）
第二代：出发菌株4株
诱变
分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）
100个 100个 100个 100个
置于检定板上
挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落
初筛
选30-50个菌株
复筛
选3-5株（提供第三代诱变出发菌株）
青霉菌的选育
2 U/ml
85000 U/ml
第二节 营养缺陷型菌株的筛选
一、营养缺陷型菌株的分离和筛选
一般包括：诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别 缺陷种类等4个步骤。
（一）营养缺陷型的诱发
青霉素淘汰细菌野生型细菌的步骤： 1. 诱变后的菌体用完全培养液振荡培养2-3代，以结束表 型延迟现象 2. 进行离心、洗涤，转移到基本培养基中进行饥饿培养46h 3. 转移到含无机氮的培养基中培养3-4h，加入一定浓度的 青霉素 4. 经涂布培养后，统计完全培养基和基本培养基上菌落的 差数，确定产生最多缺陷型的青霉素溶度
菌号 4541
诱变代数 1
菌落大小 /cm 1.3 0.8
菌落表面 结构 平滑疏松 平滑紧密
菌落颜色 可溶性色 变株效价 素 提高/% 龟背灰绿 赭石 白 火泥棕 100 2011
71046 10
B-53
C-04
11
0.6
0.4
平滑紧密
平滑紧密 平滑紧密
白
白 白
海螺橙
鱼鳃红
2642
6911
自然分离后 0.5
营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种 基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱 变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。
（二）淘汰野生型菌株 常用的方法有抗生素法和菌丝过滤法。
1. 抗生素法 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青 霉素法，后者用制霉菌素法。
淡可可棕 3547
D-756 13
二、单孢子（单细胞）悬液的制备
对菌悬液的制备有如下的要求： 1. 供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮 2. 供试细胞培养物要新鲜 3. 菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子
制备方法： 1. 采取分散法
2. 菌悬液中细胞的浓度，要求霉菌孢子浓度约为106/ml，放 线菌孢子浓度约为106-107/ml。
2. 菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌 发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。 把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左 右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱 脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3-4h过 滤一次，重复3-4次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀 释，涂皿分离。
理想的工业生产菌种必须具备： 1. 遗传性状稳定 2. 纯净无污染 3. 繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物 4. 能诱变产生遗传性变异 5. 具有产量高、收得率高
第一节 诱变育种的步骤
• 出发菌株的选择
• 单孢子（单细胞）悬液的制备
• 诱变剂及诱变剂量的选择 • 诱变处理方法 • 高产菌株的分离
2. 最佳剂量的选择： 经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株， 宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理。
要筛选具有特殊性状的菌株、较大幅度提高产量的菌株， 则用强诱变剂和高剂量处理。
对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处 理。对多核细胞菌株，用高剂量处理。
四、诱变处理方式
诱变处理方式： 单因子处理：是采用单一诱变剂处理（一般突变率低） 复合因子处理：是指采用两种以上诱变因素处理（突变率高） 分下列几种情况：
连续诱变育种过程中如何选择出发菌株? 突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提 高发酵水平不太容易。 在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上 改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过 一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加
灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系
一、出发菌株
对出发菌株的要求： 1. 对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高 2. 具有一定生产能力 3. 具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子 早而多的菌株
4. 有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。 5. 采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变 剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。 6. 在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积 少量所需产物或其前体的菌株; 而在选择产抗生素的出发 菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都 有一定程度提高的菌株作为出发菌株。
3. 制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理 时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化 而影响诱变效果。
三、诱变剂及诱变剂量的选择
1. 诱变剂种类选择
对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突 变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂。
对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂。 对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可 能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。
青霉素法的原理为：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类， 而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完 整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感， 因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细 菌。 制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇， 引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集 营养缺陷型菌株的作用。
1. 两个以上因子同时处理
2. 不同诱变剂交替处理 3. 同一诱变剂连续重复使用 4. 紫外线光复活交替处理
五、突变体的分离和筛选
随机突变，定向筛选。 筛选的条件决定了选育的方向，设计一个好的筛 选方案是诱变育种的重要前提。
出发菌株
诱变
绝大多数个体死亡 多数未变 多数负变
少数存活 少数突变 少数正变 少数变幅大
挑菌落
初筛 1瓶/株
挑50株复筛
3-5株（提供第三代诱变出发菌株）
简便筛选程序
第一代：出发菌株
诱变
分离到平皿上 打琼脂块挑菌落1000-3000 块
置于检定板上
挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落
初筛
Hale Waihona Puke 选30-50个菌株复筛
选3-5株（提供第二代诱变出发菌株）
第二代：出发菌株4株
诱变
分离到平皿上 打琼脂块挑菌落1000-3000 块
存活率
突变率
正变率
多数变幅小
高产率
多数不宜投产
少数宜投产
投产率
常规筛选程序：
第一代：出发菌株
诱变
分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）
挑选菌落 200个
初筛 1瓶/株
50株复筛
3-5株（提供第二代诱变出发菌株）
第二代：出发菌株4株
诱变
分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）
100个 100个 100个 100个
置于检定板上
挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落
初筛
选30-50个菌株
复筛
选3-5株（提供第三代诱变出发菌株）
青霉菌的选育
2 U/ml
85000 U/ml
第二节 营养缺陷型菌株的筛选
一、营养缺陷型菌株的分离和筛选
一般包括：诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别 缺陷种类等4个步骤。
（一）营养缺陷型的诱发
青霉素淘汰细菌野生型细菌的步骤： 1. 诱变后的菌体用完全培养液振荡培养2-3代，以结束表 型延迟现象 2. 进行离心、洗涤，转移到基本培养基中进行饥饿培养46h 3. 转移到含无机氮的培养基中培养3-4h，加入一定浓度的 青霉素 4. 经涂布培养后，统计完全培养基和基本培养基上菌落的 差数，确定产生最多缺陷型的青霉素溶度
菌号 4541
诱变代数 1
菌落大小 /cm 1.3 0.8
菌落表面 结构 平滑疏松 平滑紧密
菌落颜色 可溶性色 变株效价 素 提高/% 龟背灰绿 赭石 白 火泥棕 100 2011
71046 10
B-53
C-04
11
0.6
0.4
平滑紧密
平滑紧密 平滑紧密
白
白 白
海螺橙
鱼鳃红
2642
6911
自然分离后 0.5
营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种 基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱 变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。
（二）淘汰野生型菌株 常用的方法有抗生素法和菌丝过滤法。
1. 抗生素法 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青 霉素法，后者用制霉菌素法。
淡可可棕 3547
D-756 13
二、单孢子（单细胞）悬液的制备
对菌悬液的制备有如下的要求： 1. 供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮 2. 供试细胞培养物要新鲜 3. 菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子
制备方法： 1. 采取分散法
2. 菌悬液中细胞的浓度，要求霉菌孢子浓度约为106/ml，放 线菌孢子浓度约为106-107/ml。
2. 菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌 发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。 把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左 右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱 脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3-4h过 滤一次，重复3-4次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀 释，涂皿分离。