榛子

关于榛子
榛子，又称榛栗、山板栗、尖栗、棰子等，榛子属桦术科植物，为野生灌木榛子树的种子。

榛子果形似栗子，外壳坚硬，果仁肥白而圆，有香气，含油脂量很大，吃起来特别香美，余味绵绵，因此成为最受人们欢迎的坚果类食品，有“坚果之王”的称呼。

榛子分平榛、毛榛两种。

平榛扁圆形，皮厚外表光滑，果仁香甜；毛榛为锥圆形，皮薄有细微茸毛，果仁甘醇而香。

榛子营养丰富，每l00克榛子果仁中含蛋白质16．2—18克，脂肪50．6-77克，碳水化合物16．5克，灰分3．1克，钙316毫克，磷556毫克，铁8.3毫克，胡萝卜素0.13毫克，维生素B1 0.20毫克，维生素B2 0.20毫克。

榛子中钙、磷、铁含量高于其他坚果。

[美食中国]
榛子也有药用价值。

中医认为榛味甘性平，具有开胃、调中、明目之功效，可医治体弱和肠胃不适等症。

榛子既可直接食用，又可加工成榛粉，是一种营养价值很高的补养品。

榛子还有杀虫，治小儿疳积作用。

榛子本身富含油脂，使所含的脂溶性维生素更易为人体所吸收，对体弱、病后虚羸、易饥饿的人都有很好的补养作用。

它的维生素E含量高达36%，能有效地延缓衰老、防治血管硬化、润泽肌肤。

榛子里包着抗癌化学成分紫杉酚，它是红豆杉醇中的活跃成分，这种药可以治疗卵巢癌和乳腺癌以及其他一些癌症，可延长病人的生命期。

榛子还可以改良土壤,涵养水源,是水土保持的优良树种.
研究现状
在辽宁山区的榛子大多数是在野生状态下自然生长，没有进行人工科学管理，产量很不稳定，常常会出现大小年现象，致使榛树局部过密，通风透光条件较差，严重影响了果实的质量且病虫害多发，近年来，由于人们对榛子的利用价值认识逐步加深，导致掠青采摘，造成榛子的产量逐年下降。

另外，野生榛子由于没有进行人生管理，所以榛苗的结果年龄仅限在2、3年生榛苗上，超过4年的榛树，几乎见不到果实，鉴于榛子资源的现状，结合封山育林政策的实施，为了使野生资源能够得到更好的利用，逐步提高榛子的产量和质量，为山区开辟一条富民之路，很有必要对野生榛子进行科学的管理。

研究对象
（1）遗传多样性
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。

广义的遗传多样性是指地球上生物所携带的各种遗传信息的总和。

这些遗传信息储存在生物个体的基因之中。

因此，遗传
多样性也就是生物的遗传基因的多样性。

任何一个物种或一个生物个体都保存着大量的遗传基因，因此，可被看作是一个基因库（Gene pool）。

一个物种所包含的基因越丰富，它对环境的适应能力越强。

基因的多样性是生命进化和物种分化的基础。

狭义的遗传多样性主要是指生物种内基因的变化，包括种内显著不同的种群之间以及同一种群内的遗传变异（世界资源研究所，1992）。

此外，遗传多样性可以表现在多个层次上，如分子、细胞、个体等。

在自然界中，对于绝大多数有性生殖的物种而言，种群内的个体之间往往没有完全一致的基因型，而种群就是由这些具有不同遗传结构的多个个体组成的。

在生物的长期演化过程中，遗传物质的改变（或突变）是产生遗传多样性的根本原因。

遗传物质的突变主要有两种类型，即染色体数目和结构的变化以及基因位点内部核苷酸的变化。

前者称为染色体的畸变，后者称为基因突变（或点突变）。

此外，基因重组也可以导致生物产生遗传变异。

研究方法
CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法，
其原理是：采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。

CTAB法的版本有很多，不过大同小异。

以下是我使用的方法：
1.将植物组织洗净，用75％的酒精表面消毒4-5min，用去离子水冲洗3次；
2. 将样品放在灭过菌的研钵中，加入液氮捣碎，迅速转入1.5ml离心管中，加入600mlCTAB （或同时加入石英砂和CTAB研磨，然后转入1.5ml离心管中）；
3. 65℃水浴1h（每20min反转摇匀一次）；
4. 加等体积的氯仿－异戊醇（体积比24：1），或加入苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀；
5. 6500rpm离心30min，取上清于新管中；
6. 重复4，5步骤；
7. 向上清中加入2倍体积的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇）沉淀DNA，-20℃放置20min 或更长时间，或过夜；
9. 加75％的乙醇清洗DNA，每次12000rpm 2min，去上清；
10. 风干后加入40ul的TE缓冲液溶解DNA；
11. 取2ul溶液电泳检测。

引物，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。

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类型
存在有自然中生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为
DNA引物）。

一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。

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引物设计原则
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA 模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DN A序列。

如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6. 碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mo l）。

否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。

△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。

应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。

引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。

（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。

3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mo l时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dG TP对扩增的成功是有帮助的。

11. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。

有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的P
CR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。

在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。

引物设计的要求：
●避免重复碱基，尤其是G.
●Tm=58-60度。

●GC=30-80%.
●3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
●正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

●PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

●引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DN A污染的影响。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。

对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

琼脂糖凝胶糖电泳
概述
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。

普通琼脂糖凝胶分离DNA 的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

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操作流程
准备干净的配胶板和电泳槽
注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

选择电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。

注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

正确选择凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。

低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。

电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

电泳的合适电压和温度
电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。

注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象
DNA样品的纯度和状态
是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。

乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。

注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。

在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

DNA的上样
正确的DNA上样量是条带清晰的保证。

注意太多的DNA上样量可能导致DNA 带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。

Marker的选择
DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。

Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。

需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。

如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。

从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。

而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。

TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。

注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。