香椿中内生固氮菌的分离筛选与鉴定
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Key words: T oona sinensis Roem ; azo tobacter ; separ atio n purification; appr aisal
香椿 ( T oona sinensis) 是楝科香椿属落叶乔木, 一般 10～15 年可成材, 木材具有美丽的花纹, 用 途广泛, 在国际市场上享有 “中国桃花心木”之美称, 是我国特有珍贵的速生用材林树种和传统的名 贵木本蔬菜, 它全身都是宝, 具有很高的营养价值、食用价值、药用价值和材用价值[ 1- 8] , 香椿叶中总 黄酮甙元含量比银杏叶高出 2～3 倍[ 4] , 具有抑菌、抗病毒、抑制亚硝基化和抗疲劳、抗癌及增强免疫 等作用[ 9] . 此外, 香椿根系发达, 根蘖性强, 具极强的固土抗风能力. 因此, 我国山东、河北、河南、 安徽、湖南等地大力营建香椿用材林、防护林、芽菜林, 而且造林面积还在逐年扩大, 河南省将其列 为 “十大战略树种”之一. 国内对香椿的高产栽培和开发利用的研究比较多, 而对香椿的自主固氮研 究则未见报道.
转 0. 1% 新洁尔灭 3 min , 无菌水洗 3 次. 2. 2 香椿根内生固氮菌的分离、纯化与固氮活性测定
实验的结果表明, 采用 10- 3进行筛选菌落效果最好, 分离出的单菌落见图 1. 本实验从根中分离出 36 个内生固氮菌株, 采用划线法接种于 Ashby 无氮平板培养基上连续培养 6 代进行分离纯化 ( 见图 2) , 最后得到具有固氮活性的纯化菌株 4 株. 对这 4 株菌株进行固氮酶活性的测定, 结果见表 1.
13 0
福 建 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版) 2007 年
点设两个标准样地, 按对角线选 3 棵香椿, 分别采集根样品, 带回实验室后立即放入冰箱中 4℃保存. 1. 2 方法 1. 2. 1 固氮菌的分离筛选 1. 2. 1. 1 培养基的制备 ( 固氮菌的筛选分离培养采用 A shby 培养基) : 甘露醇 10. 0 g , K H2PO 4 0. 20 g , M gSO 4·7H2O 0. 20 g, N aCl 0. 20 g , CuSO 4·2H2O 0. 10 g , CaCO 3 5. 00 g , 蒸馏水 1 000 mL . 将 培养基倒入培养皿中, 120℃高压灭菌 15 m in 后备用. 1. 2. 1. 2 材料的消毒: 用毛刷将根表面的泥土刷掉, 并用自来水冲洗根系 1 h, 选取健壮的根剪成 1～ 2 cm, 按照根系的粗细不同设计不同的消毒方案, 再根据根系接种培养后的感染率和Байду номын сангаас活率筛选最佳 消毒方案. 1. 2. 1. 3 根内生菌悬液的制备: 取消毒后的根放在已灭过菌的装有石英砂的研钵中研磨成浆后, 分别 转入已灭菌的装有 50 mL 无菌水和 20～30 颗玻璃珠的 250 m L 三角烧瓶中, 于摇床上以 120 r ·min- 1 摇 30 min, 将液体倒入离心管中, 用 500 r·m in- 1的转速离心 1 min, 然后吸取上清液于已灭菌的装有 无菌水的小三角烧瓶中, 分别稀释成 10- 1、10- 2 、10- 3 3 个等级. 1. 2. 1. 4 根内生细菌和固氮菌的分离与纯化: 取 10- 1、10- 2、10- 3菌悬液各 0. 1 m L , 在无菌操作台上 分别接入已灭菌的 Ashby 培养基中, 用无菌玻璃棒涂布均匀, 重复 3 次, 在 28℃下恒温培养、观察 4 ～5 d. 将培养基上形成的单菌落分离出来, 采用三线法划线在 30℃下培养、分离出生长出来的单菌落, 将分离出来的单菌落连续在该培养基中转 6 代, 进而纯化筛选出固氮活性较高的固氮菌菌株. 1. 2. 1. 5 固氮酶活性的测定: 采用乙炔还原法将筛选纯化出的菌株接入已灭菌的装有 70～80 mL A shby 液体培养基的三角烧瓶中, 置于摇床上, 以 120 r·min- 1振荡速度在 30℃下振荡培养 2～3 d. 然 后各取 20 mL 培养的菌液分别注入已灭菌的带反口胶塞的 250 m L 注射瓶, 把反口胶塞塞紧, 抽出 10 mL 空气, 再注入 10 m L 高纯乙炔, 封好瓶塞, 置于摇床上在 26℃下振荡培养 1 h, 而后抽取 600 L 气体测定. 以注射了高纯乙炔但未加菌液的注射瓶做对照.
3. Fuz hou Senior M iddle School, Fuz hou 350007, China)
Abstract: T hro ugh t he separ ation, the pur ifica tio n and the nitr og en fixat ion activ eness deter minatio n, scr eened had the hig h nitro gen fix ation activ e T oona sinensis azot obacter .
+;
SO R( 山梨醇)
+ ; P L I( 植物尿蓝母) + ; U RE( 尿素)
—; CIT ( 枸橼酸盐)
+;
M A L ( 丙二酸盐)
+ ; T DA ( 苯 丙氨酸)
—; PXB( 多粘菌素 B) —; L A C( 乳糖)
+;
M L T ( 麦芽糖)
+ ; M AN ( 甘露醇)
+ ; XY L ( 木糖)
+ ; RA F ( 棉子糖)
V ol. 23 N o . 4 Jul. 2007
Isolation and Characterization of Endophytic Diazotrophs in Toona sinensis Roem
WU Ruo-j ing1, CHEN Fen-fei1, WANG Yi-qun1, LIN Zi -dou2, YANG Min3
图 1 菌株的筛选
图 2 菌株的分离纯化
图 3 电镜下菌株的形态
图 4 菌落形态
2. 4 固氮菌的生理生化特性与鉴定
对 GDJ-1 固氮菌进行生理生化分析的结果如下:
DP 3( 三氯新体抑菌生长) —; O F G( 葡萄糖氧化) + ; GC( 阳性生长抑制) + ; A CE( 乙酰氨)
—;
ESC( 七叶树 苷)
第 23 卷 第 4 期 2007 年 7 月
福建师范大学学报 ( 自然科学版) Jo ur nal of F ujian N or mal U niver sity ( Nat ur al Science Edition)
文章编号: 1000-5277( 2007) 04-0129-04
香椿中内生固氮菌的分离筛选与鉴定
表 1 固氮酶活 力测定结果 nmo l·h- 1·mL - 1
菌株编号
固氮酶活力
G DJ-1 G DJ-2
127. 26 10. 08
G DJ-3 G DJ-4 对照
12. 87 12. 12 8. 33
从表中可以看出与对照相比, 乙烯峰面积值为 GDJ-1 > GDJ-3> GDJ-4> GDJ-2, 其中 GDJ-1 菌株
的固氮活性最高. 2. 3 香椿内生固氮菌的形态特征
挑选出固氮活性最高的 GDJ-1 菌株采用革兰氏染色法染色的结果表明为革兰氏阴性细菌, 对其进 行透射电镜的观察形态及菌落特征的观察结果见图 3、图 4, 可以看出从香椿根中分离出的菌株的单菌 形态为杆状, 无鞭毛, 具荚膜. 菌落平均直径为 2. 2～2. 5 mm , 菌落椭圆形或近圆形, 表面光滑, 边 缘较整齐, 颜色为乳白色.
吴若菁1, 陈奋飞1, 王逸群1, 林子都2, 杨 敏3
( 1. 福建师范大学生命科学学院, 福建 福州 350108; 2. 闽侯县 林业局祥谦林业站, 福建 福州 350100; 3. 福州市高级中学, 福建 福州 350007 )
摘要: 通过分离、纯化和固氮活性测定, 筛选出了具有较高固氮活 性的香椿固氮菌. 关键词: 香椿; 固氮菌; 分离纯化; 鉴定 中图分类号: S718. 8 文 献标识码: A
A RA = ( 实际 C2 H4 峰面积×标准气含量×注射瓶容积) / ( 标准 C2H4 峰面积×进样量×培养时间 ×样品量) . 1. 2. 2 固氮菌形态学观察
将纯化筛选出的固氮活性较高的固氮菌菌株, 采用划线法接种于 Ashby 无氮平板培养基上, 于 28℃下培养 18～24 h 后, 用革兰氏染色法[ 10] 镜检; 采用负染法染色: 斜面培养基中纯化培养的细菌, 加 入 2～3 mL 双蒸水轻轻晃动, 使其形成菌悬液, 然后用 200 目铜网蘸取菌液, 滤纸吸干多余的液体, 加 2% 醋酸铀负染后用日立 H-600 型透射电子显微镜 ( T EM ) 进行观察. 菌落特征的观察采用钱存柔、董 碧江的方法[ 11] , 将固氮菌接种于 L B 琼脂培养基, 370 ℃恒温培养 24 h 后观察菌落特征 ( 大小、形态、 表面、边缘、颜色) . 1. 2. 3 固氮菌的生理生化特性以及分类学鉴定
第 4 期 吴若菁等: 香椿中内生 固氮菌的分离筛选与鉴定
1 31
后再转 0. 1% 新洁尔灭 1 min , 无菌水洗 3 次. 直径为 1 mm 左右的老根: 70% 乙醇消毒 3 min, 无菌水洗后转 0. 1% 升汞 7 min , 无菌水洗后再
转 0. 1% 新洁尔灭 2 min , 无菌水洗 3 次. 直径为 2 mm 左右的老根: 70% 乙醇消毒 3 m in, 无菌水洗后转 0. 1% 升汞 10 min , 无菌水洗后再
对固氮菌进行生理生化特性的鉴定, 最后送福建省卫生防疫站用生物梅里埃公司 WIPEK32 鉴定 仪确定其分类学地位.
2 结果
2. 1 香椿根系的消毒 实验结果表明不同粗细的根系应采用不同的消毒方法, 最佳的消毒方案分别为: 直径为 0. 5 mm 左右的新生根: 70% 乙醇消毒 2 min, 无菌水洗后转 0. 1% 升汞 4 min , 无菌水洗
( 1. College of L if e Sciences, Fuj ian N or mal U niver sity , Fuz hou 350108, China; 2. M inhou County Forestry Bureau X iangqian For estry S tation, Fuz hou 350100, China;
香椿属于前期速生植物, 喜深厚肥沃土壤. 尤其是作为速生用材林和芽菜林时, 对氮肥的需要量 更大, 长期种植将会严重剥夺地力. 因此, 本文作者开展香椿根内生固氮菌的分离、筛选与鉴定研究, 希望能够筛选出高固氮活性的香椿固氮菌来生产菌肥, 提高香椿自主固氮能力, 达到提高香椿人工林 生物量的目的.
1 材料与方法
采用 P ERKIN-ELM ER 公司生产的 Ag icent 6890N 型气相色谱仪测定菌株的固氮活性, 重复 3 次. 其工作条件设置为: 氢火焰离子化检测器, 检测器温度 250℃, H2 流量 30 mL / min, 压力 0. 14 kPa, 色谱柱为 GDX502, 长 2 m , 内径 3 mm , 柱温 40℃, 载气 N2, 流量 30 mL / m in, 压力 100 kP a, 空气 流量 400 m L / min, 压力 0. 14 m Pa. 利用乙炔还原法 ( acet ylene reduct ion assay , A RA) 确定菌株有无 固氮活性, 按下式计算固氮酶活性.
1. 1 材料来源 从闽侯县青口、宁德市三都村、六都村的香椿 ( T oona si nensis Roem) 种植地采集根样品, 每个地
收稿日期: 2006-10-30 基金项目: 福建省自然科学基金资助项目 ( B0310007) 作者简介: 吴若菁 ( 1955— ) , 女, 福建古田人, 副教授, 主要从事细胞遗传学及遗传育种研究, genet ic@ f jnu . edu. cn.
香椿 ( T oona sinensis) 是楝科香椿属落叶乔木, 一般 10～15 年可成材, 木材具有美丽的花纹, 用 途广泛, 在国际市场上享有 “中国桃花心木”之美称, 是我国特有珍贵的速生用材林树种和传统的名 贵木本蔬菜, 它全身都是宝, 具有很高的营养价值、食用价值、药用价值和材用价值[ 1- 8] , 香椿叶中总 黄酮甙元含量比银杏叶高出 2～3 倍[ 4] , 具有抑菌、抗病毒、抑制亚硝基化和抗疲劳、抗癌及增强免疫 等作用[ 9] . 此外, 香椿根系发达, 根蘖性强, 具极强的固土抗风能力. 因此, 我国山东、河北、河南、 安徽、湖南等地大力营建香椿用材林、防护林、芽菜林, 而且造林面积还在逐年扩大, 河南省将其列 为 “十大战略树种”之一. 国内对香椿的高产栽培和开发利用的研究比较多, 而对香椿的自主固氮研 究则未见报道.
转 0. 1% 新洁尔灭 3 min , 无菌水洗 3 次. 2. 2 香椿根内生固氮菌的分离、纯化与固氮活性测定
实验的结果表明, 采用 10- 3进行筛选菌落效果最好, 分离出的单菌落见图 1. 本实验从根中分离出 36 个内生固氮菌株, 采用划线法接种于 Ashby 无氮平板培养基上连续培养 6 代进行分离纯化 ( 见图 2) , 最后得到具有固氮活性的纯化菌株 4 株. 对这 4 株菌株进行固氮酶活性的测定, 结果见表 1.
13 0
福 建 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版) 2007 年
点设两个标准样地, 按对角线选 3 棵香椿, 分别采集根样品, 带回实验室后立即放入冰箱中 4℃保存. 1. 2 方法 1. 2. 1 固氮菌的分离筛选 1. 2. 1. 1 培养基的制备 ( 固氮菌的筛选分离培养采用 A shby 培养基) : 甘露醇 10. 0 g , K H2PO 4 0. 20 g , M gSO 4·7H2O 0. 20 g, N aCl 0. 20 g , CuSO 4·2H2O 0. 10 g , CaCO 3 5. 00 g , 蒸馏水 1 000 mL . 将 培养基倒入培养皿中, 120℃高压灭菌 15 m in 后备用. 1. 2. 1. 2 材料的消毒: 用毛刷将根表面的泥土刷掉, 并用自来水冲洗根系 1 h, 选取健壮的根剪成 1～ 2 cm, 按照根系的粗细不同设计不同的消毒方案, 再根据根系接种培养后的感染率和Байду номын сангаас活率筛选最佳 消毒方案. 1. 2. 1. 3 根内生菌悬液的制备: 取消毒后的根放在已灭过菌的装有石英砂的研钵中研磨成浆后, 分别 转入已灭菌的装有 50 mL 无菌水和 20～30 颗玻璃珠的 250 m L 三角烧瓶中, 于摇床上以 120 r ·min- 1 摇 30 min, 将液体倒入离心管中, 用 500 r·m in- 1的转速离心 1 min, 然后吸取上清液于已灭菌的装有 无菌水的小三角烧瓶中, 分别稀释成 10- 1、10- 2 、10- 3 3 个等级. 1. 2. 1. 4 根内生细菌和固氮菌的分离与纯化: 取 10- 1、10- 2、10- 3菌悬液各 0. 1 m L , 在无菌操作台上 分别接入已灭菌的 Ashby 培养基中, 用无菌玻璃棒涂布均匀, 重复 3 次, 在 28℃下恒温培养、观察 4 ～5 d. 将培养基上形成的单菌落分离出来, 采用三线法划线在 30℃下培养、分离出生长出来的单菌落, 将分离出来的单菌落连续在该培养基中转 6 代, 进而纯化筛选出固氮活性较高的固氮菌菌株. 1. 2. 1. 5 固氮酶活性的测定: 采用乙炔还原法将筛选纯化出的菌株接入已灭菌的装有 70～80 mL A shby 液体培养基的三角烧瓶中, 置于摇床上, 以 120 r·min- 1振荡速度在 30℃下振荡培养 2～3 d. 然 后各取 20 mL 培养的菌液分别注入已灭菌的带反口胶塞的 250 m L 注射瓶, 把反口胶塞塞紧, 抽出 10 mL 空气, 再注入 10 m L 高纯乙炔, 封好瓶塞, 置于摇床上在 26℃下振荡培养 1 h, 而后抽取 600 L 气体测定. 以注射了高纯乙炔但未加菌液的注射瓶做对照.
3. Fuz hou Senior M iddle School, Fuz hou 350007, China)
Abstract: T hro ugh t he separ ation, the pur ifica tio n and the nitr og en fixat ion activ eness deter minatio n, scr eened had the hig h nitro gen fix ation activ e T oona sinensis azot obacter .
+;
SO R( 山梨醇)
+ ; P L I( 植物尿蓝母) + ; U RE( 尿素)
—; CIT ( 枸橼酸盐)
+;
M A L ( 丙二酸盐)
+ ; T DA ( 苯 丙氨酸)
—; PXB( 多粘菌素 B) —; L A C( 乳糖)
+;
M L T ( 麦芽糖)
+ ; M AN ( 甘露醇)
+ ; XY L ( 木糖)
+ ; RA F ( 棉子糖)
V ol. 23 N o . 4 Jul. 2007
Isolation and Characterization of Endophytic Diazotrophs in Toona sinensis Roem
WU Ruo-j ing1, CHEN Fen-fei1, WANG Yi-qun1, LIN Zi -dou2, YANG Min3
图 1 菌株的筛选
图 2 菌株的分离纯化
图 3 电镜下菌株的形态
图 4 菌落形态
2. 4 固氮菌的生理生化特性与鉴定
对 GDJ-1 固氮菌进行生理生化分析的结果如下:
DP 3( 三氯新体抑菌生长) —; O F G( 葡萄糖氧化) + ; GC( 阳性生长抑制) + ; A CE( 乙酰氨)
—;
ESC( 七叶树 苷)
第 23 卷 第 4 期 2007 年 7 月
福建师范大学学报 ( 自然科学版) Jo ur nal of F ujian N or mal U niver sity ( Nat ur al Science Edition)
文章编号: 1000-5277( 2007) 04-0129-04
香椿中内生固氮菌的分离筛选与鉴定
表 1 固氮酶活 力测定结果 nmo l·h- 1·mL - 1
菌株编号
固氮酶活力
G DJ-1 G DJ-2
127. 26 10. 08
G DJ-3 G DJ-4 对照
12. 87 12. 12 8. 33
从表中可以看出与对照相比, 乙烯峰面积值为 GDJ-1 > GDJ-3> GDJ-4> GDJ-2, 其中 GDJ-1 菌株
的固氮活性最高. 2. 3 香椿内生固氮菌的形态特征
挑选出固氮活性最高的 GDJ-1 菌株采用革兰氏染色法染色的结果表明为革兰氏阴性细菌, 对其进 行透射电镜的观察形态及菌落特征的观察结果见图 3、图 4, 可以看出从香椿根中分离出的菌株的单菌 形态为杆状, 无鞭毛, 具荚膜. 菌落平均直径为 2. 2～2. 5 mm , 菌落椭圆形或近圆形, 表面光滑, 边 缘较整齐, 颜色为乳白色.
吴若菁1, 陈奋飞1, 王逸群1, 林子都2, 杨 敏3
( 1. 福建师范大学生命科学学院, 福建 福州 350108; 2. 闽侯县 林业局祥谦林业站, 福建 福州 350100; 3. 福州市高级中学, 福建 福州 350007 )
摘要: 通过分离、纯化和固氮活性测定, 筛选出了具有较高固氮活 性的香椿固氮菌. 关键词: 香椿; 固氮菌; 分离纯化; 鉴定 中图分类号: S718. 8 文 献标识码: A
A RA = ( 实际 C2 H4 峰面积×标准气含量×注射瓶容积) / ( 标准 C2H4 峰面积×进样量×培养时间 ×样品量) . 1. 2. 2 固氮菌形态学观察
将纯化筛选出的固氮活性较高的固氮菌菌株, 采用划线法接种于 Ashby 无氮平板培养基上, 于 28℃下培养 18～24 h 后, 用革兰氏染色法[ 10] 镜检; 采用负染法染色: 斜面培养基中纯化培养的细菌, 加 入 2～3 mL 双蒸水轻轻晃动, 使其形成菌悬液, 然后用 200 目铜网蘸取菌液, 滤纸吸干多余的液体, 加 2% 醋酸铀负染后用日立 H-600 型透射电子显微镜 ( T EM ) 进行观察. 菌落特征的观察采用钱存柔、董 碧江的方法[ 11] , 将固氮菌接种于 L B 琼脂培养基, 370 ℃恒温培养 24 h 后观察菌落特征 ( 大小、形态、 表面、边缘、颜色) . 1. 2. 3 固氮菌的生理生化特性以及分类学鉴定
第 4 期 吴若菁等: 香椿中内生 固氮菌的分离筛选与鉴定
1 31
后再转 0. 1% 新洁尔灭 1 min , 无菌水洗 3 次. 直径为 1 mm 左右的老根: 70% 乙醇消毒 3 min, 无菌水洗后转 0. 1% 升汞 7 min , 无菌水洗后再
转 0. 1% 新洁尔灭 2 min , 无菌水洗 3 次. 直径为 2 mm 左右的老根: 70% 乙醇消毒 3 m in, 无菌水洗后转 0. 1% 升汞 10 min , 无菌水洗后再
对固氮菌进行生理生化特性的鉴定, 最后送福建省卫生防疫站用生物梅里埃公司 WIPEK32 鉴定 仪确定其分类学地位.
2 结果
2. 1 香椿根系的消毒 实验结果表明不同粗细的根系应采用不同的消毒方法, 最佳的消毒方案分别为: 直径为 0. 5 mm 左右的新生根: 70% 乙醇消毒 2 min, 无菌水洗后转 0. 1% 升汞 4 min , 无菌水洗
( 1. College of L if e Sciences, Fuj ian N or mal U niver sity , Fuz hou 350108, China; 2. M inhou County Forestry Bureau X iangqian For estry S tation, Fuz hou 350100, China;
香椿属于前期速生植物, 喜深厚肥沃土壤. 尤其是作为速生用材林和芽菜林时, 对氮肥的需要量 更大, 长期种植将会严重剥夺地力. 因此, 本文作者开展香椿根内生固氮菌的分离、筛选与鉴定研究, 希望能够筛选出高固氮活性的香椿固氮菌来生产菌肥, 提高香椿自主固氮能力, 达到提高香椿人工林 生物量的目的.
1 材料与方法
采用 P ERKIN-ELM ER 公司生产的 Ag icent 6890N 型气相色谱仪测定菌株的固氮活性, 重复 3 次. 其工作条件设置为: 氢火焰离子化检测器, 检测器温度 250℃, H2 流量 30 mL / min, 压力 0. 14 kPa, 色谱柱为 GDX502, 长 2 m , 内径 3 mm , 柱温 40℃, 载气 N2, 流量 30 mL / m in, 压力 100 kP a, 空气 流量 400 m L / min, 压力 0. 14 m Pa. 利用乙炔还原法 ( acet ylene reduct ion assay , A RA) 确定菌株有无 固氮活性, 按下式计算固氮酶活性.
1. 1 材料来源 从闽侯县青口、宁德市三都村、六都村的香椿 ( T oona si nensis Roem) 种植地采集根样品, 每个地
收稿日期: 2006-10-30 基金项目: 福建省自然科学基金资助项目 ( B0310007) 作者简介: 吴若菁 ( 1955— ) , 女, 福建古田人, 副教授, 主要从事细胞遗传学及遗传育种研究, genet ic@ f jnu . edu. cn.