分子克隆工具酶

（10）位点偏爱 限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同
的切割效率，这种现象称位点偏爱。
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（11）酶切反应条件
①缓冲液：MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；
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需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
2. II类限制性内切酶( 93%) 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感
嗜血菌中分离出来。
（1）酶结构 相反方向结合的同源二聚体 内切酶与甲基化酶分开
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（12）星号（*）活性 在极端非标准条件下，限制酶能切割与
识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称 星号活性。
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3. III类限制性内切酶（＜1%） 二亚基双功能酶，在切割位点下游24-26bp处，
反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 在基因工程操作中用途不大。
如 EcoB和 EcoK。
（1）酶结构 三亚基双功能酶： R:限制酶亚基 M:甲基化酶亚基 S:识别DNA序列亚基
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（2）切割位点 切割位点在识别位点1000 bp以外，无特异性
Recognize site
cut
（3）作用机理
1-1.5kb
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λB
λC
菌株
EcoliK 1
10-4
10-4
EcoliB 10-4 1
10-4
EcoliC 1
1
1
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（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化 酶甲基化修饰所保护，不能被自身 的限制性内切酶识别切割。
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பைடு நூலகம்
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如
BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
U 代 表
Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
② 同序异切酶（不完全同裂酶）：
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
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（2）识别序列
DNA双链上的回文对称序列（旋转对称序列，反 向重复序列），一般长4-6bp 。
EcoR I： 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
与DNA的来源无关。
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（3）切割位点
识别位点处切开双链DNA。形成粘 性末端（sticky end）或平末端 （blunt end）。如：
P-G-G-A-G … 3’ OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
P OH
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
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4.归位内切酶 由内含子编码的内切酶，以及一些蛋白质剪切的
产物（内含肽）也有内切酶活性，这类内切酶称归位 内切酶。
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三、限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下：
3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复 系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。
4. 限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要 带上M（Modification）。（现已省略）。
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四、影响限制性内切酶活性的因素
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
产生平齐末端
HE Wenxing产生粘性末端
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（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点）
牛血清白蛋白BSA等： 有助于酶的稳定
②反应温度：大多数为37℃
③反应时间：通常1h,许多酶延长反应时间可减少酶量。
④终止酶切的方法：
a、10mM/LEDTA
b、加热，大多数酶可用65 温育5分钟失活。
C、苯酚抽提蛋白，然后用乙醇沉淀DNA。
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BamH I 5’-G 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3AI
Bgl Ⅱ
（7）切口酶 只切割双链DNA中的一条链，造成一个切
口的一类特殊的Ⅱ型限制性内切酶。
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dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。
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3. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是 37 度，少数要求40-65 度。
酶
Apa I Bcl I Mae II Taq I
ⅩhoⅠ EcoRⅠ PstⅠ
EcoRⅠ PstⅠ
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…….CTCGAG GAATTC CTGCAG GATATC TGGATCC…….. ……..GAGCTC CTTAAG GACGTC CTATAG ACCTAGG…….
ⅩhoⅠ EcoRⅠ PstⅠ
第二章 分子克隆工具酶
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第一节 限制性核酸内切酶
（Restriction endonuclease ）
一、限制性核酸内切酶
1.定义 是一类能够识别双链DNA分子中的某
种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处 切割DNA双链的核酸内切酶。
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最适温度 酶 oC
30
Apy I
50
BstE II
50
Mae III
65
最适温 度oC
30 60 55
酶
Ban I Mae I Sma I
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（5）同裂酶（Isoschizomers)
识别相同序列的限制性内切酶称同裂酶。 ①同序同切酶（完全同裂酶）：
识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。
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Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin 表示。
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2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
5’-
GAATTC
-3’
3’-
CTTAAG
-5’
5’-
G AATTC
-3’
3’-
CTTAA G
-5’
EcoRI等产生的5‘粘性末端
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
（8）Ⅱs型限制性内切酶（5%）
移动切割（shifted cleavage): 在离它的不对称识别位点一侧的特定距离
处切割DNA双链。
Hga I
5’ GACGCNNNNN 3’ CTGCGNNNNNNNNNN
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（9）DNA末端长度对限制酶切割的影响
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 3‘ … C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
粘性末端 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
1. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、 EDTA等都会影响酶的活性。
一般采取
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①纯化DNA ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）
2. DNA的甲基化程度 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：
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2.来源 原核生物
3.性质
内切酶
√
×
4.功能 自我保护作用
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细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入 细菌体内的外源DNA切成 小片断。
λ噬菌体感染率
Ecoli λK
嘌 呤；
Y
Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
代 表
嘧
Xho Ⅱ 5’-UGATCY-3’
啶。
3’-YCTAGU-5’
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Sau 3AI
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一 般不能再被原来的酶识别。
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二、限制性内切酶的类型
目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
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1. I型限制性内切酶(1%)
首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。
EcoRⅤ
BamHⅠ
Pst I
GCTGCAGC
00
TGCACTGCAGTGCA 10 10
AACTGCAGAACCAA >90 >90
EcoR I
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
>90 >90 >90 >90 >90 >90
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3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
PstI等产生的3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH 3‘ … C-G-A-G-P
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
P OH
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’-
CTGCAG
-3’
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② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸 的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。
③ 补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
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