江南大学考研发酵工程微生物课堂笔记

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↓ 设计实验方案
↓ 确定采样的生态环境 采样
↓ 确定特定的生殖条件 增殖培养基
↓确定ຫໍສະໝຸດ Baidu性或半定量的快速检测方法 纯种分离
↓ 原种斜面
确定发酵的基本条件
↓ ↗初筛(快速检测或每株 1 摇瓶培养测定) ↓
筛选 →复筛(每菌株 3-5 摇瓶) ↓
↘再复筛
↓ 较优菌株斜面(3-5 菌株)
↓ ↗ 生产性能试验
基因型:指的是一个生物体内所包含的基因,也就是说该生物的细胞内所包含的、它所 特有的那组基因。基因型这个概念是 1909 年丹麦遗传学家威廉·约翰逊引入的。一个细胞的 基因信息的总和被称为个体基因型。基因型指的是一个个体的所有等位基因的所有基因座 上的所有组合。基因型对一个生物的发展有极大的影响,但是它不是唯一的因素。一般来说 即使基因型相同的生物也会表现出不同的外显型。这个现象的机理是表观遗传学。同样的基 因在不同的生物体中可能不同地表达,因为可能受到不同环境或其他因素的影响。
重组,使不同菌株的优良特性集中于一个重组体中。通过杂交育种可以扩大变 异范围、改变产品的产量和质量,甚至创造出新产品。
包括常规杂交育种,原生质体融合,转导育种,转化育种等。 2 微生物分子育种技术 (一) 重组 DNA 技术:也称基因克隆,是将一个含目的基因的 DNA 片段经体外操作
与载体连接,并转入到受体细胞,使之在受体细胞内扩增、表达的操作过程。 DNA 重组操作过程通常包括以下步骤:①含目的基因的 DNA 片段的分离与
7 经典基因重组的方法有哪些?遗传物质的传递有什么不同?(P59) 一、 同源重组(homologous recombination)
发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination),又称基 本重组。是最基本的 DNA 重组方式,通过链的断裂和再连接。
在真核生物减数分裂中发生的同源重组是一种交互重组;在细菌的转化、 接合和普遍性转导中所发生的同源重组是一种单向重组,即仅受体发生重组, 供体并未发生改变。
制备;②载体的构建;③含目的基因的 DNA 片段与载体相连接;④将重组分子 送入受体细胞,并在其中复制、扩增;⑤筛选带有重组 DNA 分子的转化细胞; ⑥鉴定外源基因的表达产物。
重组 DNA 技术实施的 4 个必要条件:工具酶,基因,载体和受体细胞。 (二) 定向进化:是指在试管中进行的“分子进化”,即在实验室人工控制的条件下
模拟和加速生物分子向特定目标进化的过程。其对象可以是蛋白质或多肽,也 可以是核酸和其他大分子,甚至是一些生物体中的小分子。它通过人工合成或 借助于重组 DNA 技术,人为地制造大量的变异体,然后按照特定的需要和目的, 给予选择压力;或通过高通量筛选技术,将满足特定目的的分子筛选出来。
定向进化的过程包括构建文库和筛选两部分。 定向进化常用技术有:定点突变、易错 PCR、DNA 重排。 (三) 基因组重排:基因组重排技术可以看成是一种细胞水平的体内定向进化技术, 可以用来改造细菌的基因组,实现表型的改良。经典杂交技术在每一代只有两 个亲本进行重组,而重排技术则具有多亲本杂交的优势,对细菌群体进行重复 的基因组重排可以有效构建新菌株的组合文库。 (四) 代谢工程:利用 DNA 重组技术修饰细胞中特定生物化学反应(代谢途径)或引 入新的生物化学反应,以提高特定代谢物的产量或改善细胞的其他性能的学科。 代谢工程的应用领域主要有:①提高细胞已有的化学物质的产量;②产生宿主细胞本身 不能合成的新物质;③扩展细胞的底物使用范围;④形成降解毒性物质的新催化活性;⑤修 饰细胞的其他生物学特性。 采取的策略主要有:①在现存途径中提高目标产物的代谢流;②在现存途径中改变其 物质流的性质;③利用已有途径构建新的代谢旁路。
性能鉴定 →毒性试验 ↘ 菌种鉴定
↓ 菌种保藏及作为进一步育种的出发菌株
6.简述选择性培养基在育种中的应用及富集培养基在育种中的作用 选择性培养基:是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、 化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生 物从混杂的微生物中分离出来 作用:利用这类培养基可以从杂居多种微生物的样品中较容易的分离出目的被 标记有特殊生理性能的微生物, 富集培养基:是为分离某类微生物而加入助长该类微生物的营养物质或加入 抑制其他微生物生长的抑菌剂的培养基。 作用:可以通过富集将目的微生物的数量增大,以便进一步进行分离。
1 概述工业微生物育种方法 一、 传统育种方法
(一) 以基因突变为理论基础的育种方法: (1) 诱变育种: 微生物诱变育种是用人工诱变方法诱发微生物基因突变,通过随机筛
选,从多种多样的突变体中筛选出产量高、性能优良的突变体,并找出突变体的 最佳培养基和培养条件,使突变体在最适环境条件下大量合成目的产物。诱变、 筛选和改变环境因素是诱变育种的 3 个重要环节。 (2) 推理育种: 工业微生物推理育种是根据微生物代谢产物的生物合成途径和代谢调 节机制,选择巧妙的技术路线,通过人工诱发突变的技术获得改变微生物正常代 谢调节的突变株,从而人为地使目的产物选择性地大量合成和积累。推理育种的 特点是:打破了微生物代谢调节机制这一限制目的产物大量积累的天然屏障;它 的优点是:定向。工作量适中、效率高。 (二) 以基因重组为理论基础的育种方法: (1) 杂交育种:杂交育种通过微生物杂交将不同菌株的遗传物质进行转移、交换、
识别。最典型的位点特异性重组是 λ 噬菌体在 att 位点整合到 E.coli 的基因组中。 三、 转座重组
转座是重组的特殊类型,是有转座子产生的特殊行为。转座的机制依赖于 DNA 的交错切割和复制,不依赖于同源序列。
8 质粒和转座子的定义和作用 质粒为细胞染色体或核区 DNA 外能自主复制的小型环状双链 DNA 分子。大小 约为 2~200kb,通常以多拷贝(可多达几百个)形式存在于宿主细胞中。质粒 含有复制起点(ori),用于保证质粒的自主复制。质粒一般仅携有几个基因,其 中之一会赋予细菌对抗生素物质的抗性。 作用:在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多 种有用的特征于一体,如: 1) 体积小,便于 DNA 的分离和操作; 2) 呈环状,使其在化学分离过程中能保持性能稳定; 3) 有不受核基因组控制的独立复制起始点; 4) 拷贝数多,使外源 DNA 可很快扩增; 5) 存在抗药性基因等选择性标记,便于含质粒克隆的检出和选择
表现型:是与基因型相对应的概念,表现型是一个生物体的实际外表特征如大小、重量、 颜色等等。表现型主要受生物的基因型和环境影响。表现型可分为连续变异或不连续变异的。 前者较易受环境因素影响,基因型上则会受多个等位基因影响,如体重、智力和身高;后者 仅受几个等位基因影响,而且很少会被环境改变,如血型、眼睛颜色和卷舌的能力。 对于不连续变异,若有两个生物表现型相同,其基因型未必一样,这是因为其中一方可能有 隐性基因。表现型变异是进化论物竞天择理论成立的重要条件。早期的遗传学家欠缺分子生 物学技术,无从直接观察 DNA 构造,生物和其后代的表现型就是他们判别其基因型的工具。 4. 一、按变化范围分类 ㈠染色体畸变:染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。 1. 染色体数目变异
3. 染色体:细胞核内由核蛋白组成、能用碱性染料染色、有结构的线状体, 是遗传物质 基因的载体。对于原核生物来讲,由于它没有严格意义上的细胞核,只有称为拟核的区域, 位于其中的遗传物质也通常被称为染色体。
基因:是指携带有遗传信息的 DNA 序列(即基因是具有遗传效应的 DNA 片段),也 称为遗传因子,是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带 的遗传信息,从而控制生物个体的性状表现。一般来说,真核多细胞生物体中的每个细胞都 含有相同的基因,但并不是每个细胞中的每个基因所携带的遗传信息都会被表达出来。不同 部位和功能的细胞,能将遗传信息表达出来的基因也不同。
染色体组:某物种中一个正常配子所具有的一套基本染色体 1)整倍性变异:以染色体组为单位整倍地增加或减少,如 3n 2)非整倍性变异:在 2n 体基础上,增加或减少个别染色体,
如 2n-1:单体;2n-2:缺体;2n+1:三体 2. 染色体结构变异(狭义的染色体畸变) 1)重复:染色体上增加了一个或多个基因片段,使位于这个(些)片段上的基因重复出现; 2)缺失:染色体上失去了一个或多个基因片段; 3)倒位:一个染色体的某一片段以颠倒的顺序出现在原来的位置上; 4)易位:两条非同源染色体间部分相连 ㈡ 基因突变(点突变):只涉及 DNA 分子中一对或少数几对碱基的改变。
转座子是能在基因组中移位的 DNA 序列因子,它们存在于真核、原核生物中。 转座子分为两类:编码自身扩增酶系的 DNA 转座子;来自逆转录病毒的 DNA
逆转录拷贝。 作用:转座子介导的基因转移过程在原核生物和真核生物中普遍存在,并通过缺 失、插入、移动、交换等形式直接或间接地促进基因组重排事件的发生。因此 在代谢工程操作中,常将外源基因插在转座子内部,利用所形成的重组转座子将 外源基因带到宿主细胞染色体的某些位点上。
形态突变型:引起细胞个体形态和菌落形态发生改变的突变型。 致死突变型 lethal mutant :由于基因突变造成个体死亡或生命力下降的突变型。 条件致死突变型 condition lethal mutant :指在一定条件下呈致死效应,而在另一条
件下却没有致死效应的突变型,如温度敏感突变型。 生化突变型:生理生化代谢发生了改变的突变型,包括营养缺陷型、抗性突变型、
糖代谢突变型等。 营养缺陷型 auxotrophic mutant :由于代谢过程的缺陷而不能合成某种初级代谢物, 从而必须添加某种生长因子才能正常生长的突变型。 抗性突变型 resistant mutant :对药物或噬菌体具有抵抗性的突变型。 调节突变型 regulatory mutant:丧失对某一基因或操纵子表达能力调节的突变型。 ㈡遗传信息改变效应 同义突变 Silent mutation / 沉默突变 / :碱基序列发生改变而氨基酸序列未发生改 变的隐蔽突变。沉默突变的发生是由于遗传密码的简并性。例:ATT 突变为 ATC, 两者都编码异亮氨酸。 错义突变 Missense mutation :个别碱基的改变导致多肽链上某个氨基酸为另一种 氨基酸所取代。例:AAG 突变为 GAG,编码的氨基酸由亮氨酸变成谷氨酸。 无义突变 Nonsense mutation :突变使某一氨基酸的密码子变成了终止密码子。例: TGC(亮氨酸)突变为 TGA(终止密码子)。 通读突变:将终止密码子改变成有义密码子,造成通读,使多肽链延长的碱基替换。 例:TAG(终止密码子)变为 CAG(谷氨酰氨) 5. 简述野生型菌株的分离与筛选的步骤 调查研究并充分查阅资料
⒈碱基置换:DNA 分子中一个碱基对为另一个碱基对所取代。 1)转换:DNA 分子中一个嘌呤(或嘧啶)为另一个嘌呤(或嘧啶)所取代。如 AT→GC 2)颠换:DNA 分子中一个嘌呤(或嘧啶)为一个嘧啶(或嘌呤)所取代。如 AT →TA ⒉移码突变:DNA 分子中失去或插入一个或几个碱基对,从而造成其后遗传信息阅读框的 改变。 二.按突变效应分类: ㈠ 表型效应
(三)转导作用(transduction):当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次 感染另一(受体)细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的 DNA 转移及基因 重组即为转导作用。
二、 位点特异性重组(site-specific recombination) 位点特异性重组发生在特殊位点上,此位点含有短的同源序列,供重组蛋白
真核生物中,两个 DNA 分子同源序列间单链或双链片段的交换
细菌的基因转移与重组 (一)接合作用(conjugation): 接合是指两个性别不同的微生物细胞之间接触, 遗传物质转移、交换,形成一个新个体。当两个不同性别菌株接触时,遗传物质 是单向转移,并不相互交换。
(二)转化作用(transformation):转化是指相当大的游离的供体细胞 DNA 片段 被直接吸收到受体细胞内,并整合于受体细胞的基因组中,从而使受体细胞获得 供体细胞部分遗传形状的现象。
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