乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测

乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测
YLNB 3.2
1、引用依据： GB/T4789.3-2003
2、术语和定义
大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性
厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

该菌主要来源于人畜粪便，
故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品
中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100ml(g) 检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。

3、仪器及器材
3.1恒温培养箱：36±1℃；
3.2冰箱：0-4℃；
3.3恒温水浴锅：46±1℃；
3.4天平；
3.5显微镜；
3.6均质器或乳钵；
3.7灭菌平皿：直径90mm；
3.8灭菌试管：18×180和20×200；
3.9灭菌吸管：1 ml和10 ml；
3.10灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml ；
3.11灭菌玻璃珠：直径约5mm；
3.12载玻片；
3.13酒精灯；
3.14试管架；
3.15灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。

4、培养基和试剂
4.1乳糖胆盐发酵管；
4.2伊红美兰琼脂平板；
4.3乳糖发酵管；
4.4生理盐水；
4.5革兰氏染色液。

5、检验程序
大肠菌群检验程序: 检样
稀释
乳糖胆盐发酵管
36± 1℃， 24± 2h
不产气产气
大肠菌群阴性伊红美兰琼脂平板
36± 1℃， 18~24h
报告
革兰氏染色乳糖发酵管36± 1℃， 24± 2h 革兰氏阳性革兰氏阴性无芽孢杆菌产气不产气
大肠菌群阴性大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
6、方法
6.1检样稀释
6.1.1以无菌操作将检样25ml（或 g）放于装有225ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量
的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10 的均匀稀释液。

固体检样最好用均质器，以8000～10000r/min 的速度处理1min ，做成 1： 10 的均匀稀释液。

6.1.2用1ml灭菌吸管吸取1：10 稀释液 1ml，注入含有 9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成
1： 100 的稀释液。

6.1.3另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10 倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml 灭菌吸管。

6.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选
择三个稀释度，每个稀释度接种 3 管。

6.2乳糖发酵实验：（通常所说的假定试验：其目的在于检
查样品中有无发酵产生气体的细菌）
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml 以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml 及 1ml 以下者，用单料乳糖胆
盐发酵管。

每一稀释度接种 3 管，置 36± 1℃培养箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

6.3分离培养：（目的在于检查乳糖初发酵试验呈阳性反应
的试管内，有无需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌存
在）
将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃培养箱内，培养18～ 24h，然后取出，观察菌落形态，并
做革兰氏染色和证实实验。

6.4证实实验（复发酵实验）: (目的在于证明从乳糖初发
酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆
菌，确能发酵乳糖产生气体)
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2 个进行革兰氏
染色，同时接种乳糖发酵管，置36± 1℃培养箱内，培养24 ±2h，观察产气情况。

凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的
无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。

6.5报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数查MPN检索表 , 报告每 100ml （g）大肠菌群的最可能数（见表1）。

7、注意事项
7.1初发酵和证实试验
乳糖发酵试验不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性并
不代表大肠菌群阳性，因此，必须作进一步证实试验。

7.2产气量与倒管
试验表明，大肠菌群的产气量与大肠菌群的检出率呈正
相关系。

但也随样品的种类而变。

大肠菌群的产气量多者可
充满整个倒气管，少者可产生比小米粒还小的气泡。

如果对
产酸但未产气的乳糖发酵管如有疑问，可用手轻轻打动试管, 如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进
一步试验。

另外，产气量与倒气管有一定的关系，倒气管口
不完整，有利于气体的进入；管口周围有沉淀等物质能影响
气体的进入。

7.3挑选菌落
在平板呈现紫黑色，有或无金属光泽，检出率最高；粉
红色、粉色检出率最低。

另外，只挑选一个菌落影响大肠菌
群的检出率，当菌落不典型时，应挑取2～3 个菌落作证实
试验，以免出现假阴性。

7.4抑菌剂
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸
钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。

胆盐的主要作用是
抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。

有些抑菌剂用
量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此
抑菌剂的添加应严格按照标准方法添加。

7.5 指示剂
溴甲酚紫属于酸碱指示剂，其pH变色范围为：黄 5.2～6.8 紫，当料管中培养基（pH=7.4 ±0.1 ）的颜色由紫色变为
黄色时，证明培养基中有酸性物质产生，此时培养基的PH ≤5.2，培养基呈酸性。

7.6 MPN 检索表
MPN为最大可能数的简称，表示样品中活菌的密度，是用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。

MPN检索表只给出了三个稀释度，如果改用不同的稀释度，则表内数值应相应
降低或增加10 倍。

7.6.1用于初发酵试验或复发酵试验的小导管内应无气泡，
有气泡时就不能使用，接种之后，要用同批未接种的发酵管
置于温箱内，同时培养，作为空白。

7.6.2检查初发酵试验的乳糖胆盐管内是否有乳糖分解菌存
在时，应以产气为主，产酸仅作参考。

因为培养基中所用
的指示剂为溴甲酚紫，其有效PH为 5.2-6.8，变色点为 6.0，如果产酸未能达到使下降至 6.0 以下时，变色就不显著。

7.6.3检查发酵管中小导管内气泡时，即使只有微量气泡出
现，亦应判定为阳性。

有时小导管的管口被样品颗粒封住，
气体未能进入导管，如加以振摇，管低有小气泡上升，亦应
视为阳性。

7.6.4大肠菌群细菌能分解乳糖产酸，使伊红和美兰结合而
成黑色物，故菌落呈紫黑色（大肠杆菌）或褐色（产气克雷
伯氏菌等），前者有时还产生有金属光泽。

表1大肠菌群最可能数（MPN）检
索表
阳性管数MPN 阳性管数MPN
1 10-1 10-
2 100ml(g 1 10-1 10-2 100ml(g
) )
0 0 0 ＜30 2 0 0 90
0 0 1 30 2 0 1 140
0 0 2 60 2 0 2 200 0 0 3 90 2 0 3 260 0 1 0 30 2 1 0 150 0 1 1 60 2 1 1 200 0 1 2 90 2 1 2 270 0 1 3 120 2 1 3 340 0 2 0 60 2 2 0 210 0 2 1 90 2 2 1 280 0 2 2 120 2 2 2 350 0 2 3 160 2 2 3 420 0 3 0 90 2 3 0 290 0 3 1 130 2 3 1 360 0 3 2 160 2 3 2 440
0 3 3 190 2 3 3 530
1 0 0 40 3 0 0 230 1 0 1 70 3 0 1 390 1 0
2 110
3 0 2 640 1 0 3 150 3 0 3 950 1 1 0 70 3 1 0 430 1 1 1 110 3 1 1 750 1 1 2 150 3 1 2 1200 1 1 3 190 3 1 3 1600
1 2 0 110 3 2 0 930
1 2 1 150 3 2 1 1500
1 2 2 200 3 2 2 2100
1 2 3 240 3 2 3 2900
1 3 0 160 3 3 0 2400
1 3 1 200 3 3 1 4600
1 3
2 240
3 3 2 11000
1 3 3 290 3 3 3 ≥ 24000
注：①本表采用 3 个稀释度【 0.1g(mL) 、0.01 g(mL) 、0.001 g(mL) 】、每个稀释度接种 3 管。

②表内所列检样量如改用1g(mL) 、 0. 1 g(mL)、0.01 g(mL) 时，表内数字相应降低10 倍；如改用 0.01g(mL) 、0.001 g(mL) 、0.0001 g(mL)时，表内数字相应增加10 倍，其余类推。