基因克隆操作过程PPT课件

BamHI
GGATCC CCTAGG
BamHI
CTGCA G
a)连接产物中 目的基因的方 向是确定的。
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GATCC G
退火
GATCC G
CTGCA G G ACGTC
G GATCC CCTAG G
T4-DNA ligase
CTGCAG GACGTC
GGATCC CCTAGG
基因克隆.操作过程
第六章 基因克隆操作过程
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基因克隆.操作过程
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基因克隆操作过程概述
1.DNA的体外重组——酶切 和连接（切、接）
2.重组DNA分子的转化和扩 增（转、增）
3.转化子的筛选和鉴定（检）
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基因克隆.操作过程
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restriction endonuclease
DNA ligase
切
接
转
增 检
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基因克隆.操作过程
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一、DNA的体外重组（切与接）
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基因克隆.操作过程
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1.DNA的体外重组（一）——切
• 工具：限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） • 作用对象：目的基因片段、载体 • 目的：获得具有互补粘性末端（或平末端）的线性目的
5' GATCC G
G GATCA CCTAG T
b)需要鉴定目 5'
T GATCC ACTAG G
的基因的连接
方向；
T4-DNA ligase
G GATCA CCTAG T
c)目的产物中 5' 对应位置的序 5' 列不再是原来 的酶切位点
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TGATCC ACTAGG
TGATCC ACTAGG
CTGCAG GACGTC
PstI
CTGCA G
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（5）人工粘性末端的连接：5’突出末端
5'
G
5' AATTC
CTTAA 5'
G
Klenow
补平
EcoRI
5'
5' GATCC G
Klenow
G
BamHI
CCTAG 5'
补平
5'
GAATT
5' AATTC
CTTAA 5'
TTAAG
5'
TdT
dGTP
5'
GCATG 3'
GGATCA CCTAGT
GGATCA CCTAGT
. 基因克隆操作过程
G CCTAG 5'
5' 5'
5来自百度文库 5'
13 13
（3）不同粘性末端的连接
5'
CTGCAG
5'
GACGTC
5'
PstI
5'
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5'
T4-DNA polymerase
切平
GGATCC CCTAGG
基因片段和线性化载体
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基因克隆.操作过程
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EcoR I
Hind III Pvu II
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基因克隆.操作过程
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各种限制酶酶切反应所使 用的buffer（Takara）
双酶联合酶切所使用的buffer（Takara）
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基因克隆.操作过程
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单酶切实例（Takara）
BamHI
5' GATCC G
Klenow
GGATCC
CCTAGG
5'
G CCTAG 5'
补平
5'
C
G
a)获得连接方
向不同的两种
产物；
5'
b)需要鉴定目 的基因的连接 5'
方向；
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G
C
5'
T4-DNA ligase
5' GATCC CTAGG
CGATCC GCTAGG
GGATCG CCTAGC
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（2）同尾酶产生的粘性末端的连接
• 同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶。 • 同尾酶一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。所有钝
末端酶产生的末端均是相同的，但一般不作为同尾酶来 研究。 • 同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同 ，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同 • 基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大
5'
GAATTGGGGGGGATCC
CTTAACCCCCCCTAGG
BamHI
GGATCCCCCCCAATTC
CCTAGGGGGGGTTAAG
5'
GGATCCCCCCCAATTC
CCTAGGGGGGGTTAAG
5'
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获得连接基因方克向隆不.操作同过的程两种产物
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（6）人工粘性末端的连接：3’突出末端
5' GATCC CTAGG
TdT
GGATC CCTAG 5'
dCTP
GAATTGGGGGG
AATTC
CTTAA
GGGGGGTTAAG
GATCC CCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCC CCTAG
退火
T4-DNA ligase
BamHI
5'
GAATTGGGGGGGATCC
CTTAACCCCCCCTAGG
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基因克隆.操作过程
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（1）单酶切产生的粘性末端的连接
5'
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
5'
G
5' AATTC
CTTAA 5'
G
退火
GAATTC
CTTAAG
5'
G
5' AATTC
CTTAA 5'
G
5'
G AATTC
G AATTC
a)获得连接方 5' 向不同的两种
CTTAA G
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基因克隆.操作过程
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双酶联合酶切实例（Takara）
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基因克隆.操作过程
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2. DNA的体外重组（二）——接
• 工具：DNA连接酶（DNA ligase） • 作用对象：具有互补粘性末端（或平末端）的线性目的
基因片段和线性化载体 • 目的：获得含有目的基因的环状载体
Takara网站提供的同尾酶信息
.
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基因克隆操作过程
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5'
TGATCA
ACTAGT
5'
BclI
5'
GGATCC
CCTAGG
BamHI
GGATCC
CCTAGG
5'
5'
T
5' GATCA
ACTAG 5'
T
5'
a)获得连接方 向不同的两种 5' 产物；
退火
T GATCC ACTAG G
G AATTC CTTAA G
CTTAA G
5'
G AATTC
CTTAA G
5'
产物；
T4-DNA ligase
b)需要鉴定目 5' 的基因的连接
GAATTC CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
5'
方向
5'
GAATTC
GAATTC
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CTTAAG
CTTAAG
基因克隆.操作过程
5'
5'
CGATCC GCTAGG
GGATCG CCTAGC
基因克隆.操作过程
GGATC CCTAG 5'
c)目的产物中 对应位置的序 5' 列不再是原来 的酶切位点
5'
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（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接
CTGCAGNNNNNNNNNGGATCC GACGTCNNNNNNNNNCCTAGG
PstI