差异蛋白质组学在神经系统疾病生物标志物筛选中的研究进展

山东医药2019年第59卷第22期

•综述•

差异蛋白质组学在神经系统疾病生物标志物

筛选中的研究进展

安东打袁正伟2

(1中国医科大学附属第一医院，沈阳110001；2中国医科大学附属盛京医院卫生部

小儿先天畸形重点实验室)

摘要:差异蛋白质组定量分析是蛋白质组学研究的关键技术之一。该技术具有自动化、高通量及高敏感性等特点，可用于复杂样本的检测,并且对生物体液样品的需要量较少，可以在神经系统疾病临床初期检测出新的标志物。目前国内外很多学者已将差异蛋白质组学技术应用于神经系统疾病生物标志物的筛查研究，为神经系统肿瘤、神经退行性变、颅脑缺血损伤、神经发育畸形等疾病的诊断、预后评估和治疗靶标的选择提供了候选生物标志物。

关键词：神经系统疾病；差异蛋白质组学；生物标志物

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2019.22.027

中图分类号:R741.04文献标志码:A文章编号：1002-266X(2019)22-0089-05

蛋白质组学是在大规模水平上对某一特定细胞、组织、体液中所有蛋白质进行研究的学科。基因组学、蛋白质组学、代谢组学分别从基因、蛋白质和代谢产物角度研究，共同构成现代生物研究的重要手段,为生命科学的发展提供了广阔前景［］。差异蛋白质组学是蛋白质组学研究的主要策略之一，借助该技术可以筛选出不同因素引起的样本之间的差异蛋白质谱，同时获得对某些关键蛋白的认识和功能分析。作为研究生命现象的手段和方法,差异蛋白质组学技术对发现疾病诊断标志物、研究疾病发病机制、寻找新的靶向治疗药物有重要的应用价值。神经系统是人体非常复杂的器官系统，神经系统的疾病种类多样,临床表现各异，病因复杂，发病机理不清,诊断和治疗都面临巨大挑战。差异蛋白质组学技术能从众多复杂的基因和蛋白质中筛选出一组改变明显的关键性分子,找到疾病发生、发展的候选标志物。现就差异蛋白质组学研究的主要技术手段以及神系统的差蛋白组分析

研究综述如下。

1差异蛋白质组学技术

1.1基于双向凝胶电泳(2-DE)定量技术传统2-DE技术其原理是根据等电点和分子量两个方面将蛋白分。，现了差

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81601292；81671469、国家重点研发计划项目(2016YFC1000505)。

通信作者：安东(E-mail：andongsuper@)凝胶电泳(DIGE)o DIGE的技术原理是将荧光染色技术与双向电泳技术相结合，首先对测试样品用不同荧光染料标记，然后将混合样品在同一块凝胶上进行双向电泳，使测试样品的蛋白质在同一平面显示不同的荧光，从而区分蛋白质点不同荧光的差异,实现蛋白质的相对定量。该方法与传统的2-DE相比有助于完全二维分析和量化,克服了其重复性差的问题。但DIGE只适用于标记含有赖氨酸的蛋白，否则将使用特殊荧光染料，费用较为昂贵。

1.2基于液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)定量技术目前基于LC-MS/MS定量技术飞速发展,已经成为蛋白质组学研究的主要分析手段，其灵敏度更高、检测范围更大,且检测速度快、自动化程度高，可以实现蛋白质组学研究高通量、高深度的要求。其方法进一步分为两种:非标记定量技术和稳定同素标记定。

1.2.1非标记定量技术非标记定量通过比较样品中蛋白质酶解后多肽的质谱分析次数或质谱峰强度进行定量分析。该技术包括两种定量方法。基于二级谱图的非标记定量技术利用蛋白肽段匹配的二级谱图计数实现蛋白定量,基于一级质谱的非标记定量是比较一级谱图中的质谱峰面积强度或离子信号强度进行相对定量。非标记定量所需样品制备简单、无需标记、试验速度快、成本较低。近年来，基于一级质谱的蛋白质非标记定量技术随着配套数据处理软件和程序不断开发，该技术得到了较广泛的应

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用。但是在高丰度蛋白存在时，谱图数可能达到饱和造成结果不准确，且只依据一级质谱和数据模型定量，准确率不高，且重现性差［2］。

1-2-2稳定同位素标记定量技术是向测试样品中引入稳定同位素标记，通过比较不同同位素标记物的质谱信号强度实现不同样品中蛋白质的相对定量分析。稳定同位素标记方法与相对非标记定量相比,定量更为准确，重复性好。根据同位素标记引入方式的不同，分为体内标记和体外标记两类。细胞培养中稳定同位素标记氨基酸（SILAC）是经典的体内标记定量技术，其原理是利用轻、重同位素标记的必需氨基酸培养细胞,细胞经过若干次传代，细胞内新合成蛋白质被同位素稳定标记，然后将样品混合,根据两种不同同位素标记肽段的面积或峰强度比实现对蛋白质的相对定量。SILAC技术可以把时间维度与定量蛋白质组学相结合，从而对蛋白质组动态变化进行研究。体外化学标记常用方法主要有基于一级质谱的同位素亲和标签（ICAT）技术、基于串联质谱的等重同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术和串联质量标签（TMT）技术等。ICAT技术通过特异性结合半胱氨酸琉基的ICAT试剂来标记肽段，而后进行分离纯化和质谱鉴定，根据一级质谱图中标记肽段的面积比实现相对丰度的定量。该技术可以简便、快速、准确比较样品中球蛋白的表达。基于串联质谱的iTRAQ标记技术是目前差异蛋白质组学研究中应用最广的技术，所采用的标本来源广泛，可将脑组织、脑脊液、血浆、细胞、体液等各种样品中的蛋白质经胰蛋白酶酶切为多肽后用iTRAQ 标记，通过比较第二级质谱中不同样品的报告离子峰强度进行相对定量分析。具有灵敏度高、标记效率高、蛋白质覆盖率高，数据丰富，定量准确、可信度高、重复性好等优点［］。通过在样本中加入已知量的经iTRAQ标记的标准品做内标，还可进行蛋白质的绝对定量。基于iTRAQ技术的差异蛋白组学研究方法已成为发现疾病生物标志物的主要分析手段。TMT试剂与iTRAQ试剂的原理类似，可以对2组、6组、10组同标记。前TMT试

在蛋白质组学研究中应用日趋增长，该定量技术还可以通过与高分辨质谱技术和其他标记技术相结合,实现更高通量、更深精度的蛋白质组学定量分析［4］。

2差异蛋白质组学技术在神经系统疾病生物标志物筛选中的应用

生物标志物作为机体在疾病状态下的分子信号，可以呈现为体液中的循环物质，也可以定位于细90胞内部，是诊断、监测疾病、评估治疗和判断预后的重要标志。利用差异蛋白质组学可以在组织或体液中进行定性、定量研究,高通量筛查出系列特异生物分子。这些生物标志物可以应用于神经系统肿瘤、神经退行性疾病、神经缺血损伤、神经发育畸形的诊断及治疗。

2-1神经系统肿瘤确诊中枢神经系统肿瘤通常需要活检，基于蛋白质组学技术寻找血浆标志物作为一种非侵入性的诊断手段成为现今的研究热点。目前对神经系统肿瘤（如多形性胶质细胞瘤、星形细胞瘤）蛋白和基因的表达已有很多研究。Miyau-chi等⑸用SWATH质谱技术分析比较了胶质瘤患者与正常人群血浆差异蛋白，结果发现LRG1、C9、CRP、GSN、IGHA1、APOA4具有较好的诊断价值，并且发现LRG1、CRP、C9与肿瘤大小呈明显正相关。

Petushkova等［6］利用蛋白翻译后修饰组学研究发现了胶质母细胞瘤患者血浆乙酰化和泛素化修饰的异常。Polisetty等［7］应用高分辨质谱技术分析了弥漫性星形胶质细胞瘤的差异膜蛋白组，与已报道的转录组数据比对，发现190种差异蛋白在两组不同组学数据中表达趋势一致。在新近研究中,Spreafico 等［8］用脑脊液蛋白质组鉴定了儿童脑肿瘤扩散转移的预测标记物，其中验证了6种蛋白（1型胶原、胰岛素样结合蛋白4、前胶原C-肽链内切酶增强子1、神经胶质细胞系衍生神经营养因子受体a2、胰蛋白酶a抑制剂重链4、神经增殖和分化控制蛋白-1）在肿瘤转移病例组与对照组有显著差异。2017年Gu等［9］比较了来源于W期髓母细胞瘤患儿的原发肿瘤和移肿瘤细胞系的差蛋白，发现1400种显著变化的差异蛋白,这些差异蛋白包括一些已知的对肿瘤转移有促进或抑制作用的蛋白，同时也发现了大量未知作用的蛋白，此为将来进一步研究髓母细胞瘤转移标记物提供了线索。

2-2神性疾病神性疾病发病率

年有明显的上升趋势，由于其发病机制尚不清楚，治疗也缺乏有效方法和手段。由于脑脊液与脑组织中细胞外液直接相连，中枢神经系统发生病变时，会影响脑脊液中的组成成分，因此检测脑脊液蛋白质组学对中枢神经疾病的诊断、治疗和预后判定具有重要意义。脑脊液蛋白质组学的研究代表了对中枢神经系统生理及病理变化认识层次的深入。Abdi 等［0］利用iTRAQ标记技术通过脑脊液蛋白质组学研究了神经退行性疾病阿尔茨海默病（AD）、帕金森病和路易体痴呆征患者脑脊液中蛋白质表达的差异，检测鉴定出1500多种蛋白质，发现了大量的差