枸杞中总黄酮的分析方法及提取工艺研究

枸杞中总黄酮的分析方法及提取工艺研究
作者：李铭芳, 李淑芳,汪小强,阮红强
来源：《天津农业科学》2011年第01期
摘要：以乙醇为溶剂，采用回流提取法提取宁夏枸杞中的总黄酮。

通过正交试验，对影响提取效果的主要因素包括提取温度、提取时间、乙醇浓度和固液比进行优化。

通过试验研究发现最优提取条件为：提取温度70 ℃,提取时间2.0 h,乙醇浓度70%,固液比为1∶20。

此法为枸杞中黄酮类化合物的提取提供了参考。

关键词：宁夏枸杞；总黄酮；正交设计；回流提取
中图分类号：R931.7文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.012
Analysis and Extractions of Bio-Flavonoid from Lycium Barbarum
LI Ming-fang1, LI Shu-fang2, WANG Xiao-qiang1, RUAN Hong-qiang1
（1. College of Science, Jiangxi Aricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China; 2. Chemistry Group, Jiangxi Dongxiang No.1 Middle School, Dong xiang, Jiangxi 330018, China）
Abstract：In this paper, ethanol as solvent，refluxing extraction method used to extract total flavonoids of Ningxia Lycium barbarum. Optimize the impact of extraction of the major factors by orthogonal experiments, included extraction temperature, extraction time, ethanol concentration and the ratio of solid to liquid. The experiment found that the optimal extraction conditions were as follows: extraction temperature 70 ℃, extraction time 2.0 h, the concentration of 70% ethanol, the solid-liquid ratio of 1∶20. This method for extraction of flavonoid compounds to provide a reference.
Key words: Ningxia lycium barbarum; total flavonoids; orthogonal design; reflux extraction
植物宁夏枸杞(Lycium barbarum L. )的成熟干燥果实,具有滋补肝肾、益精明目之功效,现代临床上广泛用于调节免疫功能、降血脂、降血糖、保肝、抗肿瘤及抗衰老等[1]。

枸杞之所以具有上述功能,一般认为与其所含黄酮类化合物、枸杞多糖、类胡萝卜素和甜菜碱等活性成分有关,特别是与枸杞中黄酮类化合物密切相关[2]。

随着黄酮类化合物研究开发的热潮,宁夏枸杞中黄酮类化合物的抗氧化活性开始得到关注[3-5]。

黄酮类化合物( Flavonoids) 是植物经光合作用产生的一大类化合物, 其结构母核是以C6-
C3- C6 为骨架的2-苯基色原酮。

它的存在形式有两种, 一种是游离的苷元, 另一种是与糖等结
合的苷。

黄酮类化合物作为一种功效成分, 具有多种有益的生理功能和药理作用, 越来越引起人们的重视。

黄酮类化合物的生理活性作用较为广泛, 具有生物抗氧化性、清除自由基作用、抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂降血压作用、降低血糖作用、抗癌作用、镇痛作用、免疫作用、抗炎作用、抗菌作用、对消化性溃疡的保护作用等药用保健功能。

由于黄酮优越的生理功能特性,使其可广泛应用于功能性食品中, 涉及功能食品的许多方面, 如防衰、防癌、提高免疫力、降脂、降压食品等。

此外，黄酮类化合物还可作为天然保健性食品添加剂,如天然甜味剂、天然色素、天然抗氧化剂等广泛地应用在各类食品中[3-6]。

目前，黄酮类化合物提取方法采用较多的有：(1)有机溶剂提取法；(2)微波提取法；(3)超临界萃取法；(4)超声波辅助提取法。

可用的检测方法有：(1)分光光度法； (2)纸色谱法；(3)薄层色谱法（TLC）；(4)极谱法； (5)气相色谱法；(6)高效液相色谱法( HPLC)；(7)毛细管电泳法[7-9]。

根据以上各种提取方法及分析方法的特点，结合实际情况，我们选择了以乙醇为有机溶剂的回流提取法进行提取，以分光光度法测定总黄酮的含量。

本试验通过对宁夏枸杞中总黄酮的提取方法研究，为宁夏枸杞品质的正确评价、进一步综合开发利用宁夏枸杞资源奠定理论基础，提供科学的依据和参考。

1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为宁夏枸杞。

仪器：723 PCS光栅分光光度计（上海欣茂仪器有限公司，723型），电子天平（奥豪斯（上海）公司，NO.AR2140），电热恒温水浴锅（江苏省金坛市京华仪器有限公司，DF-Ⅱ），电热鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司，DHG-9101-2型），高速万能粉碎机（FW-100型）。

试剂：芦丁(rutin)标准品（比利时进口，北京化学试剂有限公司），亚硝酸钠
（NaNO2）、硝酸铝（Al(NO3)3 ），氢氧化钠（NaOH），乙醇。

1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制标准溶液的配制：准确称取芦丁标准品0.005 0 g,以70%乙醇溶解,待溶解后用70%的乙醇定容到100 mL容量瓶中，即得浓度为 0.5 mg·mL-1的标准溶液。

1.2.2标准曲线的绘制分别吸取0.50，1.00，
1.50，
2.00，2.50，
3.00，3.50，
4.00，4.50，
5.00 mL的标准溶液至25 mL容量瓶中，分别加入0.80 mL 5%的NaNO2溶液，混匀后放置6 min；然后再加入0.80 mL 10 %的 Al(NO3)3 溶液，混匀后放置6 min；最后加入10.00 mL 4%的NaOH溶液，以70%的乙醇定容，摇匀，放置10 min；以试剂作空白参比, 在波长 510 nm 处进行比色测定。

测定结果以浓度（C）mg·mL-1为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，用最小二乘法求出回归方程,得到线性回归方程为：
C= 0.097 28 A + 0.001 62 ；相关系数为 R2=0.999 6 。

1.2.3样品的制备枸杞于65 ℃烘干粉碎后，过250 μm筛，以四分法制得粉状样品，置于干燥器内备用。

准确称取样品5.000 0 g于磨口圆底烧瓶中（其中加入不同浓度的乙醇溶液），置于恒温水浴锅中，提取黄酮，经浓缩过滤后定容至100 mL。

放入冰箱4 ℃保存备用。

1.2.4样品中总黄酮含量的测定测量样品时，从中准确吸取5.00 mL溶液于25 mL容量瓶中；加入0.80 mL 5%的NaNO2，混匀后放置6 min；然后再加入0.80 mL 10%的Al(NO3)3溶液，混匀后放置6 min；最后再加入10.00 mL 4%的NaOH溶液，以70%的乙醇定容，摇匀，放置10 min；以试剂空白作为参比,在510 nm处对样品进行测定。

根据线性回归方程得到总黄酮的浓度。

枸杞中总黄酮含量的计算：
总黄酮含量=×100%
2结果与分析
2. 1单因素试验方法
2. 1. 1 乙醇浓度对提取效果的影响分别取枸杞粉样品5 g，料液比 1∶10，提取温度 70 ℃,提取时间 1.5 h,共5组，分别用浓度为30%、45%、60%、75%、90%的乙醇,将枸杞粉和乙醇溶液置于冷凝回流的装置中进行加热浸提, 过滤并合并浸提液,按1.2.4法测定黄酮提取率。

结果见图1。

图1表明，乙醇作为浸提溶剂的较适浓度范围为60%～90%,当乙醇尝试超过70%时，提取率没有显著提高。

因此选择乙醇浓度 60%、70%，80% 作为正交试验的较优水平。

2.1.2 提取时间对提取效果的影响分别取枸杞粉样品5 g, 乙醇浓度 70%，料液比 1∶10，提取温度 70 ℃,共5组，提取时间分别为 1.0，1.5，2.0，
2.5，
3.0 h 。

将枸杞粉和乙醇溶液置于冷凝回流的装置中进行加热浸提, 过滤并合并浸提液, 按1.2.4法测定黄酮提取率。

结果见图2。

图2表明，提取时间在 1.5～2.5 h 较为合适，当提取时间超过 2 h 时，提取率没有显著提高。

因此，选择提取时间 1.5，2.0，2.5 h作为正交试验较优水平。

2.1.3 提取温度对提取效果的影响分别取枸杞粉样品5 g, 乙醇浓度 70%，料液比 1∶10,提
取时间1.5 h，共5组，提取温度分别为40 ，55，70，85，
100 ℃。

将枸杞粉和乙醇溶液置于冷凝回流的装置中进行加热浸提, 过滤并合并浸提液，
按1.2.4法测定黄酮提取率。

结果见图3。

图3表明，提取温度在60～80 ℃较为合适，当温度达到100 ℃时，黄酮类物质被破坏。

因此，选择提取温度 60，70，80 ℃作为正交试验较优水平。

2.1.4固液比对提取效果的影响分别取枸杞粉样品5 g，乙醇浓度 70%，提取温度 70 ℃，
提取时间1.5 h，共5组，固液比分别为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 。

将枸杞粉和乙醇溶液置于冷凝回流的装置中进行加热浸提, 过滤并合并浸提液，按1.2.4法测定黄酮提取率。

结果见图4。

图4表明，固液比在1∶15～1∶20内较为合适，当超过1∶20时，黄酮提取的效果提升
不明显。

因此，选择提取的固液比 1∶10，1∶15，1∶20 作为正交试验较优水平。

2. 2 正交试验设计
为了进一步找出温浸法提取的最佳试验条件，将乙醇浓度（A），提取时间（B），固液
比（质量比）（C），水浴温度（D）4个因素进行正交试验设计。

试验因素水平见表1。

采用L9（34）正交表进行试验，以总黄酮得率为考察指标。

2. 3 试验的最佳条件
通过对试验误差的计算，并以试验误差去检验各因素的显著性，最后经方差分析可知。

影响总黄酮提取的因素为D＞B＞C＞A，即水浴温度＞提取时间＞固液比＞乙醇浓度。

由于采用了单因素试验优化实验条件，使得A、B、C、D因素对其均无显著性影响（P＞0.05），故确定最佳提取工艺为D2B2C3A2，因为早连续提取法中70 %的乙醇提取时总黄酮的含量较高，
所以本试验确定提取时间为2.0 h,水浴温度为70 ℃，固液比为1∶20，乙醇浓度为70%为优选提取工艺。

试验结果见表2，分析结果见表3。

2. 4 样品分析
当使用优选提取工艺D2B2C3A2，即提取时间为2.0 h,水浴温度为70 ℃，固液比为
1∶20，乙醇浓度为70%，提取枸杞中的总黄酮，平行做3组。

此条件下黄酮提取率平均可达0.736%。

2. 5 加标回收试验
为了考察方法的可行性，本试验取一份提取液样品，进行了加标回收试验，结果见表4。

结果表明，回收率在93.16%～105.2% 之间，准确度较好，表明方法可行。

回收率=× 100%
3结论
本试验采用以乙醇为溶剂回流提法提取枸杞中黄酮类化合物,研究了不同乙醇浓度、浸提时间、料液比、提取温度对黄酮类化合物提取效果的影响。

采用分光光度计法, 以芦丁为标准样, 测定黄酮提取率。

试验结果表明: （1）采用以乙醇为溶剂的回流提取时，影响总黄酮提取的主次因素依次为：水浴温度＞提取时间＞固液比＞乙醇浓度。

（2）宁夏枸杞中黄酮类化合物的最佳提取工艺为: 提取温度70 ℃,提取时间2.0 h,乙醇浓度70%,固液比为1∶20，此条件下黄酮提取率可达0.736%。

参考文献：
[1] 方建国,丁水平,田庚元. 枸杞多糖药理作用与临床应用[J] .医药导报,2004 ,23(7) :484-485.
[2] 王金章,王秀娟. 枸杞子的化学成分和药理研究概况[J].天津药学,1999 ,11 (3) :42-15.
[3] 白寿宁. 宁夏枸杞研究(上、下册) [M] . 银川:宁夏人民出版社,1999 :591-620.
[4]张颖,张立睦,周红英,等. 不同产地枸杞子中黄酮含量的测定[J] . 中国中医药科技,2004 ,11 (2) :102-103.
[5] 黄元庆,鲁建华,沈泳,等. 枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究[J] . 卫生研究,1999 ,28 (2) :115-116.
[6] 蔡健, 华景清, 王薇, 等.黄酮提取工艺研究进展[J].淮阴工学院学报, 2003, 12(5):82-85.
[7] 张德权, 台建祥, 付勤. 生物类黄酮的研究及应用概况[J]. 食品与发酵工业, 1999, 25(6): 52-57.
[8] 张岩,曹国杰,张燕,等.黄酮类化合物的提取以及检测方法的研究进展[J].天津科技大学学报,2008,29(1):154-156.
[9] 王炜, 王琳.黄酮类化合物的研究进展[J].沈阳医学院学报, 2002, 4(2):115-119.。