蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
From DNA to Protein From Protein to Metabolite
蛋白质组学研究现状
数据库：NCBI-PUBMED 时间：2011年9月5日
条件：标题检索
词汇：物种名+proteome
蛋白质组学主要研究方向
¾ 表达蛋白质组学：
9 人类肝脏蛋白质组计划 9 人类血浆蛋白质组计划
双向电泳操作常见问题实例
症 状：整体出现纵向拖尾 可能原因：TEMED过期失效或不足量 改 进：加入足量并且有效的TEMED
双向电泳操作常见问题实例
症 状：蛋白出现整体性的模糊横条纹，蛋白点少 可能原因：蛋白聚焦时间不足 改 进：选择合适的等电聚焦时间
pH=4-7, 24cm, 200ug Vhours=64000
蛋白提取常见问题实例
症 状：蛋白点数目差异较大 可能原因：不同裂解液蛋白裂解能力不同 改 进：选用裂解能力强的裂解液
¾ Lysis A (1826 spots)：8M尿素、 2%CHAPS、20mMDTT、0.5% CA (pH=46.5)
¾ Lysis B (1337 spots)：7M尿素、2M硫 脲、4%CHAPS、25mMDTT、1% CA (pH=4-6.5)
7
12% SDS-PAGE
CBB Stain
Silver Stain
蛋白质双向凝胶电泳
荧光差异双向电泳
目录
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
生物样品分类
细菌
植物
真菌 其它
动物
生物分类
亚细胞 细胞
体液 其它
组织
形态分类
生物样品分类
样品制备要求
¾ 高溶解能力：尽可能提取出最大量的蛋白，减少蛋白损失 ¾ 去杂：多糖、DNA、蜡质、多酚、油脂 ¾ 高浓度：蛋白沉淀、冻干、超滤进行浓缩 ¾ 去高丰度蛋白：白蛋白、IgG、Rubisco ¾ 避免蛋白损失和人为修饰：减少操作步骤、含尿素溶液温度
不要超过37度
¾ 避免降解：减少操作步骤、低温操作、添加蛋白酶抑制剂
¾ Lowary法：碱性条件蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物，
该复合物将磷钼酸-磷钨酸还原后显色 9 优点：灵敏度20-250ug 9 缺点：费时、干扰物质多(Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基 化物、酚类、柠檬酸等)，标准曲线的直线关系不严格
蛋白上样量
¾ 胶条pH范围：范围越窄，上样量越大 ¾ 胶条长度：胶条越长，上样量越大 ¾ 染色方法：灵敏度越低，上样量越大 ¾ 有效蛋白比：比例越低，上样量越大
Add 30mM NaCl
No Salt
蛋白提取常见问题实例
症 状：部分区段产生严重背景 可能原因：样品多糖、多酚等成分的干扰 改 进：可以采用丙酮沉淀、TCA沉淀或添加PVPP等方式去除杂质
蛋白提取常见问题实例
症 状：蛋白丢失比较严重且堆积在一个小区域范围内 可能原因：蛋白溶液中有TCA等酸性物质残留 改 进：采用丙酮沉淀等方法充分去除酸性物质
常用裂解液： ¾ Tris裂解液：40mM Tris (pH=9.5) ¾ 尿素裂解液：9M 尿素、4%CHAPS、1%DTT、1% CA ¾ 尿素硫脲裂解液：7M 尿素、2M硫脲、4%CHAPS、1%DTT、1% CA
常用样品保存方法及保存时间
特性 保存时间
4度保存于 冷冻保存于- 冻干成蛋白 蛋白溶液 20度、-80度 干粉后冷冻
或液氮条件 保存
1个月
数年
数年
反复使用次数 多次
一次
一次
蛋白提取常见问题实例
症 状：靠近酸性端形成纵向分割，形成“半面妆” 可能原因：硫脲使烷基化不完全 改 进：裂解液中不添加硫脲
Buffer：7M尿素、2M硫脲、
Buffer：9M尿素、4%CHAPS、
4%CHAPS、1%DTT、1%IPG buffer 1%DTT、1%IPG buffer
双向电泳操作常见问题实例
症 状：部分区域垂直方向出现连续横条纹 可能原因：蛋白水化不充分 改 进：水化液体积需足量、水化时间足够长
双向电泳操作常见问题实例
症 状：碱性端蛋白纵向拖尾 可能原因：等电聚焦过程中的DTT丢失 改 进：加入足量并且有效的DTT，胶条水化后采用杯上样，采用TBP
代替DTT
Drystrip: pH=4-7
蛋白提取常见问题实例
症 状：出现拖尾、蛋白点少、蛋白点分布不均匀 可能原因：蛋白样品杂质去除不干净 改 进：选用TCA/丙酮沉淀法或其它方法去除干扰物质
直接裂解法提取蛋白
TCA/丙酮沉淀法提取蛋白
蛋白提取常见问题实例
症 状：产生分段横条纹 可能原因：盐离子的干扰 改 进：可以采用丙酮沉淀、超滤以及clean up试剂盒处理的方法进行 上样前的盐离子去除，也可以采用杯上样、搭盐桥或者缓慢升压等方法 在电泳时进行盐离子去除
以动植物组织为例：
特性 细胞壁
动物组织 无
植物组织 有
液泡
无
有
蛋白含量
高
低
次生代谢物
低
高
¾ 细胞壁：增强细胞坚韧程度，同时也增加细胞破碎难度
¾ 液泡：含有多糖多酚类物质，干扰蛋白提取
¾ 蛋白含量：需要的样本量与样本蛋白含量高低密切相关，同时蛋白 含量较低的植物样品往往需要通过一些方法进行蛋白富集
¾ 次生代谢物：植物组织次生代谢物质含量高，一方面降低蛋白含 量、另外也可能干扰蛋白提取
pH=4-7, 24cm, 200ug Vhours=100000
蛋白平衡操作细节
¾ 等电聚焦完成后的胶条可以马上进行平衡，也可以用保鲜膜包裹 后放在-80度条件下长期保存 ¾ 胶条平衡前用半干滤纸吸取胶面上的覆盖油和多余样品，可以有 效减少纵条纹的产生 ¾平衡两次，每次15分钟，时间太短会导致平衡不充分，影响蛋白 分离效果，太长则会引起蛋白丢失 ¾ 可以采用丙烯酰胺替代IAA进行第二步平衡操作，效果也不错 ¾ 平衡缓冲液体积需足量且淹没整根胶条 ¾ 平衡后将胶条在电泳缓冲液中浸泡一下有助于蛋白更好地向第二 向胶转移
双向电泳操作经验及解析
目录
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
目录
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
蛋白质组学研究必要性
¾ 生物调控机制的复杂性：涉及多个基因的多个层次的系统调节 ¾ 蛋白质：基因功能的执行者，调控更为直接 ¾ 蛋白质组学：从全局和整体的角度发现去解决问题，分析更为全面 ¾ 蛋白质组学与代谢组学等其它策略相结合：发展的新趋势
双向电泳操作常见问题实例
症 状：碱性端出现大量蛋白未能得到很好的分离 可能原因：胶条pH范围选择不正确 改 进：根据样品情况选择合适pH范围的胶条
pH=4-7
双向电泳操作常见问题实例
症 状：蛋白点较少 可能原因：蛋白上样量过低 改 进：加大蛋白上样量
750ug
1500ug
双向电泳操作常见问题实例
¾ 比较蛋白质组学：
9 动物疾病的发病机制 9 植物抗逆的分子机理 9 生物标志物发掘
¾ 蛋白质互作组学 ¾ 蛋白质翻译后修饰
蛋白质组学研究常用技术
凝胶
双向凝胶电泳(2-DE) 荧光差异双向电泳(DIGE)
非凝胶
二维色谱(2D-HPLC) 毛细管电泳(HPCE)
一级质谱(MS-PMF) 串联质谱(MS/MS) 部分序列比对(Sequence Query)
分离 计算机辅助（PDquest、Mascot）
鉴定
蛋白质双向凝胶电泳
¾ 优点：蛋白质组研究的经典技术、分辨率高、可视性好 ¾ 缺点：重复性不高、对于极端等电点和极端分子量蛋白分离效果不好
蛋白质双向凝胶电泳
部分仪器设备
等电聚焦仪
SDS-PAGE电泳仪
凝胶扫描仪
蛋白质双向凝胶电泳
常规双向电泳
pH4
样wk.baidu.com破碎方法
¾ 机械方法：
9 液氮研磨：细菌、动植物组织 9 高速匀浆：细菌、动植物组织
¾ 物理方法：
9 超声处理：细菌、脑组织匀浆、培养的动物细胞 9 反复冻融：培养的动物细胞 9 冷热交替：培养的动物细胞
¾ 化学方法：
9 裂解液裂解：培养的动物细胞 9 酶溶解：细菌、酵母
常用制备方法
直接裂解法：
其它方法：
9 硫酸铵沉淀法 9 酚抽提法 9 酒精提取法 9 ……
蛋白裂解液配置
蛋白裂解液成分： ¾ 变性剂：尿素、硫脲 ¾ 去污剂：两性去污剂(CHAPS)、非离子去污剂(NP-40、Triton-
100)、阴离子去污剂(SDS)
¾ 还原剂：DTT、DTE、TBP、2-巯基乙醇 ¾ 增溶剂：两性电解质、Tris碱
表：参考上样量(材料为无明显高丰度蛋白的样品、胶条长度24cm)
pH范围 3-10
4-7
染色方法 银染 考染 银染 考染
上样量(ug) 150-300 500-1000 200-400 1000-1500
胶条与两性电解质的对应关系
常用非线性胶条的pH分布规律
等电聚焦操作细节
¾ 胶条从冰箱中取出后需在室温平衡10分钟才可使用 ¾ 蛋白溶液在上样前需充分离心以去除不溶性杂质 ¾ 加入蛋白溶液时，尽量使溶液保持连贯，并避免气泡产生 ¾ 蛋白溶液体积要足量以免水化不充分 ¾ 放入胶条时需从一端开始缓慢连续放入，避免气泡产生，如有气 泡可通过缓慢来回拖动胶条将气泡赶走 ¾ 设置缓慢升压步骤有利于除盐和除杂 ¾ 夏天空气湿度过大时注意及时除湿
胶条转移及SDS-PAGE电泳操作细节
¾ 采用琼脂糖封胶时注意防止胶条和第二向凝胶表面产生气泡（建 议夏天采用普通琼脂糖、冬天采用低熔点琼脂糖进行封胶） ¾ 灌制SDS-PAGE凝胶时注意胶溶液、灌胶槽以及室温保持一致， 可以使灌制的凝胶更均匀 ¾ 灌制凝胶时先缓慢加入胶液，待底部气体去除后再稍快加入剩下 的胶液，可以有效防止底部气泡的产生 ¾ 控制凝胶在2小时内凝固完全 ¾ 加胶条前，采用电泳缓冲液冲洗SDS-PAGE凝胶上表明，有利于蛋 白从胶条向第二向凝胶的转移 ¾ 分两步进行SDS-PAGE电泳，有效防止纵条纹的产生
症 状：高丰度蛋白点中间颜色比周边浅 可能原因：银染蛋白过饱和 改 进：选择合适的蛋白上样量
双向电泳操作常见问题实例
症 状：高丰度蛋白出现横纹 可能原因：蛋白上样量过高 改 进：适当降低蛋白上样量，如有过可能，尽量去除高丰度蛋白
双向电泳操作常见问题实例
症 状：纵向区域出现严重波浪纹 可能原因：聚焦槽中有水分未去除 改 进：准备等电聚焦前先把聚焦槽自然风干或者烘干
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
蛋白定量
¾ Bradford法：染料与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和
芳香族氨基酸残基结合显色 9 优点：灵敏度1-5ug、速度快、操作简单、显色稳定 9 缺点：不同蛋白检测浓度有偏差，SDS、去污剂、Tritonx100等对检测有干扰，标准曲线有轻微的非线性
¾Lysis C (1033 spots)：8M尿素、 4%CHAPS、25mMDTT、0.5% CA (pH=46.5)
¾ Lysis D (2226 spots)：5M尿素、 2M硫 脲、 2%CHAPS、2%SB3-10、20mMDTT、 5mM TCEP、0.5% CA (pH=4-6.5)、0.5% CA (pH=3-10)
等电聚焦电压设置
¾ 低压水化：50V-12h
pH4
7
¾ 缓慢升压除盐：100V-1h，
200V-1h，500V-1h，1000V-
1h，1000-10000V-1h
¾ 高压聚焦：10000V-10h
¾ 低压维持：500V-nh
12% SDS-PAGE
24cm Drystrip, CBB stain-1000ug
蛋白提取常见问题实例
症 状：出现连续横向拖尾 可能原因：蛋白溶解不充分 改 进：选用蛋白溶解性强的裂解液，上样前充分离心
蛋白提取常见问题实例
症 状：蛋白出现在低分子量区域 可能原因：蛋白提取过程中的蛋白降解 改 进：注意获取样品后及时冷冻保存，样品提取过程中注意低温， 裂解液中添加蛋白酶抑制剂
目录
9 优点：操作简单，速度快、蛋白得率高 9 缺点：杂质多 9 适用样品：动物组织或细胞
TCA/丙酮沉淀法：
9 优点：蛋白纯度高 9 缺点：操作繁琐、速度慢，蛋白损失多 9 适用样品：植物组织、体液、胞外分泌蛋白
常用制备方法
超滤法：
9 优点：操作简单，速度快 9 缺点：费用贵 9 适用样品：胞外分泌蛋白、体液、尿液
蛋白质组学研究现状
数据库：NCBI-PUBMED 时间：2011年9月5日
条件：标题检索
词汇：物种名+proteome
蛋白质组学主要研究方向
¾ 表达蛋白质组学：
9 人类肝脏蛋白质组计划 9 人类血浆蛋白质组计划
双向电泳操作常见问题实例
症 状：整体出现纵向拖尾 可能原因：TEMED过期失效或不足量 改 进：加入足量并且有效的TEMED
双向电泳操作常见问题实例
症 状：蛋白出现整体性的模糊横条纹，蛋白点少 可能原因：蛋白聚焦时间不足 改 进：选择合适的等电聚焦时间
pH=4-7, 24cm, 200ug Vhours=64000
蛋白提取常见问题实例
症 状：蛋白点数目差异较大 可能原因：不同裂解液蛋白裂解能力不同 改 进：选用裂解能力强的裂解液
¾ Lysis A (1826 spots)：8M尿素、 2%CHAPS、20mMDTT、0.5% CA (pH=46.5)
¾ Lysis B (1337 spots)：7M尿素、2M硫 脲、4%CHAPS、25mMDTT、1% CA (pH=4-6.5)
7
12% SDS-PAGE
CBB Stain
Silver Stain
蛋白质双向凝胶电泳
荧光差异双向电泳
目录
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
生物样品分类
细菌
植物
真菌 其它
动物
生物分类
亚细胞 细胞
体液 其它
组织
形态分类
生物样品分类
样品制备要求
¾ 高溶解能力：尽可能提取出最大量的蛋白，减少蛋白损失 ¾ 去杂：多糖、DNA、蜡质、多酚、油脂 ¾ 高浓度：蛋白沉淀、冻干、超滤进行浓缩 ¾ 去高丰度蛋白：白蛋白、IgG、Rubisco ¾ 避免蛋白损失和人为修饰：减少操作步骤、含尿素溶液温度
不要超过37度
¾ 避免降解：减少操作步骤、低温操作、添加蛋白酶抑制剂
¾ Lowary法：碱性条件蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物，
该复合物将磷钼酸-磷钨酸还原后显色 9 优点：灵敏度20-250ug 9 缺点：费时、干扰物质多(Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基 化物、酚类、柠檬酸等)，标准曲线的直线关系不严格
蛋白上样量
¾ 胶条pH范围：范围越窄，上样量越大 ¾ 胶条长度：胶条越长，上样量越大 ¾ 染色方法：灵敏度越低，上样量越大 ¾ 有效蛋白比：比例越低，上样量越大
Add 30mM NaCl
No Salt
蛋白提取常见问题实例
症 状：部分区段产生严重背景 可能原因：样品多糖、多酚等成分的干扰 改 进：可以采用丙酮沉淀、TCA沉淀或添加PVPP等方式去除杂质
蛋白提取常见问题实例
症 状：蛋白丢失比较严重且堆积在一个小区域范围内 可能原因：蛋白溶液中有TCA等酸性物质残留 改 进：采用丙酮沉淀等方法充分去除酸性物质
常用裂解液： ¾ Tris裂解液：40mM Tris (pH=9.5) ¾ 尿素裂解液：9M 尿素、4%CHAPS、1%DTT、1% CA ¾ 尿素硫脲裂解液：7M 尿素、2M硫脲、4%CHAPS、1%DTT、1% CA
常用样品保存方法及保存时间
特性 保存时间
4度保存于 冷冻保存于- 冻干成蛋白 蛋白溶液 20度、-80度 干粉后冷冻
或液氮条件 保存
1个月
数年
数年
反复使用次数 多次
一次
一次
蛋白提取常见问题实例
症 状：靠近酸性端形成纵向分割，形成“半面妆” 可能原因：硫脲使烷基化不完全 改 进：裂解液中不添加硫脲
Buffer：7M尿素、2M硫脲、
Buffer：9M尿素、4%CHAPS、
4%CHAPS、1%DTT、1%IPG buffer 1%DTT、1%IPG buffer
双向电泳操作常见问题实例
症 状：部分区域垂直方向出现连续横条纹 可能原因：蛋白水化不充分 改 进：水化液体积需足量、水化时间足够长
双向电泳操作常见问题实例
症 状：碱性端蛋白纵向拖尾 可能原因：等电聚焦过程中的DTT丢失 改 进：加入足量并且有效的DTT，胶条水化后采用杯上样，采用TBP
代替DTT
Drystrip: pH=4-7
蛋白提取常见问题实例
症 状：出现拖尾、蛋白点少、蛋白点分布不均匀 可能原因：蛋白样品杂质去除不干净 改 进：选用TCA/丙酮沉淀法或其它方法去除干扰物质
直接裂解法提取蛋白
TCA/丙酮沉淀法提取蛋白
蛋白提取常见问题实例
症 状：产生分段横条纹 可能原因：盐离子的干扰 改 进：可以采用丙酮沉淀、超滤以及clean up试剂盒处理的方法进行 上样前的盐离子去除，也可以采用杯上样、搭盐桥或者缓慢升压等方法 在电泳时进行盐离子去除
以动植物组织为例：
特性 细胞壁
动物组织 无
植物组织 有
液泡
无
有
蛋白含量
高
低
次生代谢物
低
高
¾ 细胞壁：增强细胞坚韧程度，同时也增加细胞破碎难度
¾ 液泡：含有多糖多酚类物质，干扰蛋白提取
¾ 蛋白含量：需要的样本量与样本蛋白含量高低密切相关，同时蛋白 含量较低的植物样品往往需要通过一些方法进行蛋白富集
¾ 次生代谢物：植物组织次生代谢物质含量高，一方面降低蛋白含 量、另外也可能干扰蛋白提取
pH=4-7, 24cm, 200ug Vhours=100000
蛋白平衡操作细节
¾ 等电聚焦完成后的胶条可以马上进行平衡，也可以用保鲜膜包裹 后放在-80度条件下长期保存 ¾ 胶条平衡前用半干滤纸吸取胶面上的覆盖油和多余样品，可以有 效减少纵条纹的产生 ¾平衡两次，每次15分钟，时间太短会导致平衡不充分，影响蛋白 分离效果，太长则会引起蛋白丢失 ¾ 可以采用丙烯酰胺替代IAA进行第二步平衡操作，效果也不错 ¾ 平衡缓冲液体积需足量且淹没整根胶条 ¾ 平衡后将胶条在电泳缓冲液中浸泡一下有助于蛋白更好地向第二 向胶转移
双向电泳操作经验及解析
目录
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
目录
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
蛋白质组学研究必要性
¾ 生物调控机制的复杂性：涉及多个基因的多个层次的系统调节 ¾ 蛋白质：基因功能的执行者，调控更为直接 ¾ 蛋白质组学：从全局和整体的角度发现去解决问题，分析更为全面 ¾ 蛋白质组学与代谢组学等其它策略相结合：发展的新趋势
双向电泳操作常见问题实例
症 状：碱性端出现大量蛋白未能得到很好的分离 可能原因：胶条pH范围选择不正确 改 进：根据样品情况选择合适pH范围的胶条
pH=4-7
双向电泳操作常见问题实例
症 状：蛋白点较少 可能原因：蛋白上样量过低 改 进：加大蛋白上样量
750ug
1500ug
双向电泳操作常见问题实例
¾ 比较蛋白质组学：
9 动物疾病的发病机制 9 植物抗逆的分子机理 9 生物标志物发掘
¾ 蛋白质互作组学 ¾ 蛋白质翻译后修饰
蛋白质组学研究常用技术
凝胶
双向凝胶电泳(2-DE) 荧光差异双向电泳(DIGE)
非凝胶
二维色谱(2D-HPLC) 毛细管电泳(HPCE)
一级质谱(MS-PMF) 串联质谱(MS/MS) 部分序列比对(Sequence Query)
分离 计算机辅助（PDquest、Mascot）
鉴定
蛋白质双向凝胶电泳
¾ 优点：蛋白质组研究的经典技术、分辨率高、可视性好 ¾ 缺点：重复性不高、对于极端等电点和极端分子量蛋白分离效果不好
蛋白质双向凝胶电泳
部分仪器设备
等电聚焦仪
SDS-PAGE电泳仪
凝胶扫描仪
蛋白质双向凝胶电泳
常规双向电泳
pH4
样wk.baidu.com破碎方法
¾ 机械方法：
9 液氮研磨：细菌、动植物组织 9 高速匀浆：细菌、动植物组织
¾ 物理方法：
9 超声处理：细菌、脑组织匀浆、培养的动物细胞 9 反复冻融：培养的动物细胞 9 冷热交替：培养的动物细胞
¾ 化学方法：
9 裂解液裂解：培养的动物细胞 9 酶溶解：细菌、酵母
常用制备方法
直接裂解法：
其它方法：
9 硫酸铵沉淀法 9 酚抽提法 9 酒精提取法 9 ……
蛋白裂解液配置
蛋白裂解液成分： ¾ 变性剂：尿素、硫脲 ¾ 去污剂：两性去污剂(CHAPS)、非离子去污剂(NP-40、Triton-
100)、阴离子去污剂(SDS)
¾ 还原剂：DTT、DTE、TBP、2-巯基乙醇 ¾ 增溶剂：两性电解质、Tris碱
表：参考上样量(材料为无明显高丰度蛋白的样品、胶条长度24cm)
pH范围 3-10
4-7
染色方法 银染 考染 银染 考染
上样量(ug) 150-300 500-1000 200-400 1000-1500
胶条与两性电解质的对应关系
常用非线性胶条的pH分布规律
等电聚焦操作细节
¾ 胶条从冰箱中取出后需在室温平衡10分钟才可使用 ¾ 蛋白溶液在上样前需充分离心以去除不溶性杂质 ¾ 加入蛋白溶液时，尽量使溶液保持连贯，并避免气泡产生 ¾ 蛋白溶液体积要足量以免水化不充分 ¾ 放入胶条时需从一端开始缓慢连续放入，避免气泡产生，如有气 泡可通过缓慢来回拖动胶条将气泡赶走 ¾ 设置缓慢升压步骤有利于除盐和除杂 ¾ 夏天空气湿度过大时注意及时除湿
胶条转移及SDS-PAGE电泳操作细节
¾ 采用琼脂糖封胶时注意防止胶条和第二向凝胶表面产生气泡（建 议夏天采用普通琼脂糖、冬天采用低熔点琼脂糖进行封胶） ¾ 灌制SDS-PAGE凝胶时注意胶溶液、灌胶槽以及室温保持一致， 可以使灌制的凝胶更均匀 ¾ 灌制凝胶时先缓慢加入胶液，待底部气体去除后再稍快加入剩下 的胶液，可以有效防止底部气泡的产生 ¾ 控制凝胶在2小时内凝固完全 ¾ 加胶条前，采用电泳缓冲液冲洗SDS-PAGE凝胶上表明，有利于蛋 白从胶条向第二向凝胶的转移 ¾ 分两步进行SDS-PAGE电泳，有效防止纵条纹的产生
症 状：高丰度蛋白点中间颜色比周边浅 可能原因：银染蛋白过饱和 改 进：选择合适的蛋白上样量
双向电泳操作常见问题实例
症 状：高丰度蛋白出现横纹 可能原因：蛋白上样量过高 改 进：适当降低蛋白上样量，如有过可能，尽量去除高丰度蛋白
双向电泳操作常见问题实例
症 状：纵向区域出现严重波浪纹 可能原因：聚焦槽中有水分未去除 改 进：准备等电聚焦前先把聚焦槽自然风干或者烘干
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
蛋白定量
¾ Bradford法：染料与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和
芳香族氨基酸残基结合显色 9 优点：灵敏度1-5ug、速度快、操作简单、显色稳定 9 缺点：不同蛋白检测浓度有偏差，SDS、去污剂、Tritonx100等对检测有干扰，标准曲线有轻微的非线性
¾Lysis C (1033 spots)：8M尿素、 4%CHAPS、25mMDTT、0.5% CA (pH=46.5)
¾ Lysis D (2226 spots)：5M尿素、 2M硫 脲、 2%CHAPS、2%SB3-10、20mMDTT、 5mM TCEP、0.5% CA (pH=4-6.5)、0.5% CA (pH=3-10)
等电聚焦电压设置
¾ 低压水化：50V-12h
pH4
7
¾ 缓慢升压除盐：100V-1h，
200V-1h，500V-1h，1000V-
1h，1000-10000V-1h
¾ 高压聚焦：10000V-10h
¾ 低压维持：500V-nh
12% SDS-PAGE
24cm Drystrip, CBB stain-1000ug
蛋白提取常见问题实例
症 状：出现连续横向拖尾 可能原因：蛋白溶解不充分 改 进：选用蛋白溶解性强的裂解液，上样前充分离心
蛋白提取常见问题实例
症 状：蛋白出现在低分子量区域 可能原因：蛋白提取过程中的蛋白降解 改 进：注意获取样品后及时冷冻保存，样品提取过程中注意低温， 裂解液中添加蛋白酶抑制剂
目录
9 优点：操作简单，速度快、蛋白得率高 9 缺点：杂质多 9 适用样品：动物组织或细胞
TCA/丙酮沉淀法：
9 优点：蛋白纯度高 9 缺点：操作繁琐、速度慢，蛋白损失多 9 适用样品：植物组织、体液、胞外分泌蛋白
常用制备方法
超滤法：
9 优点：操作简单，速度快 9 缺点：费用贵 9 适用样品：胞外分泌蛋白、体液、尿液