液相色谱柱的选择和方法开发
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水中； 20min梯度，10 30%B；60°C，
1.5ml/min
由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大
柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I
硅胶纯度－金属含量
OH OH
OH
2.3-二羟基萘
HO
2.7-二羟基萘
Venusil MP C18 5μm, 4.6mm×150mm Brand H, C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
硅胶双层表面修饰后 • 新增加表面层硅羟基活性更低－新硅羟基pH=5.2， 普通硅
羟基pH约为3.5 更对称的峰型，提高柱效，提高灵敏度
• 硅胶表面更均匀－硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖
重现性更好
• 表面纯度更高－硅胶金属杂质被覆盖
极性化合物保留和分离更好
键性化合物峰形对比
C18 (non-endcapped, twin-layer
液相色谱柱的选择和方法开发
天津博纳艾杰尔科技/Agela Technologies （US）
内容概要
色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发 制备液相 混合固定相----优化复杂样品分离的一个新策
略 如何改善强水溶性化合物的保留和分离
色谱基本概念回顾
ห้องสมุดไป่ตู้
色谱（chromatography）
O CH3 Si O CH3 O CH3
Hydrolysis
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R OH
ＬＯＤ：Limit of Detection ＬＯＱ：Limit of Quantification
－ 柱效 －峰形（拖尾因子）
重现性
分离度（Ｒ） －保留时间（Ｖ，Ｔ，Ｋ） －选择性（ α） －柱效 （Ｎ）
灵敏度
色谱柱类型、选择和方法开发
色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响
分离度《 - 选择性 〈 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 - 柱效 〈 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速
2.275 253.288
Area:
2.450 3.471
3.008 4.084
40
50 40
35
30
TF=1.31
30
TF=1.42
40
25
30
20
20
20
15
10
10
10
A2r.ea8:84900.399
TF=1.39
5
0
0 0
0
1
2
3
4
5
6
7
min
0
1
2
3
4
5
6
7
min
0
1
2
3
4
5
6
min
Brand Z,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
• Rs - Resolution • N – Theoretical Plate Number •α– Selectivity • k – Retention Factor •拖尾
幻灯片制作：WSY18
1.Separation of Compounds A and B
幻灯片制作：WSY18
灵敏度
解决方法
封尾 双层表面修饰 表面杂化
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
封尾
键合填料与小硅烷进行后续反应，如三 甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，
以增加表面覆盖率。
缺点：
TMS
不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被 反应） 在pH<3时，TMS易流失，耐用性，稳定 性不好
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
样品分子直径小于平均孔 径，才能进入微粒内部
孔径至少是样品流体学直 径的4倍
300Ǻ孔径用于：超过50个 氨基酸的肽或25个残基的低 聚寡核苷酸
样品分子直径小于平均孔径， 才能进入微粒内部
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II
条件： C8色谱柱，4.6×150mm， 3.5um，
A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－
不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
双层表面修饰
降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀
Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H
Brand A C18 2.1×50mm, 5µm
Phenomenex Luna C18, 2.0×50mm, 5µm
双层表面修饰
代表产品：
Venusil MP C18， Venusil ASB C18， Venusil HILIC
固定相对色谱柱性能的影响：键合类型
A 纵向交联：保留和选择不稳定 B 横向交联：宽pH适用，Durashell，Gemini C 单体键合：重现性好，柱效高 D 单体（空间保护）：低pH稳定（Zorbax SB，Venusil ASB） Ｅ极性官能团嵌合反相固定相 ( Zorbax Bonus RP, Venusil HLP)
P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺 B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯
固定相对色谱柱性能的影响：
基质表面特性+键合类型 〉键合相的稳定性
键合相的稳定性 • 低pH值，键合相流失
• 高pH值，硅胶溶解
影响色谱柱寿命，方法不重现
键合类型对键合相稳定性影响
低pH值，键合相流失
键合类型对键合相稳定性影响（II）
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 • 窄径柱 ( 2.1mm) – 满足检测器和样品量限制 • 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命
制备柱 (内径> 10 mm) – 用于纯化制备
柱填料对色谱柱性能的影响
空间位阻保护，延缓键合相流失
空间位阻键合代表产品： Venusil ASB C18 Zorbax SB C18
固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性
高pH值，硅胶基质溶解
pH9时，色谱柱的稳定性
固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性
碳杂化，延硅胶缓高pH值水解
表面碳杂化 Agela Durashell RP Phenomenex Gemini
Brand A C18( nonendcapped, )
Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6) = 70/30 Temperature: 30 oC Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm
Brand W, AQ Column 5μm, 4.6mm×150mm
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091702.D)
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091208.D)
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07090605.D)
杂化颗粒： Waters Xterra
表面碳杂化示意图
pH=12 条件下的稳定性
4 amines, ACN/ 1% Ammonia aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x 150 mm, 5um
CH3 O H3C O Si O CH3 O CH3
O CH3
Si O Si O Si O Si O CH3
OOO
O CH3
Si O Si O Si O H
OOO
O CH3
Si O Si O Si O Si O CH3
OOO
O CH3
Si O Si O Si O H
OOO Si O Si O Si O
颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高.
柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积
每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间
增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I
多孔材料的95%以上表面 在孔内部
固定相对色谱柱性能的影响：
基质表面特性+键合类型 〉反相键合相的保留行为
同一厂家相同硅胶基质的反相柱：
• 保留值随含碳量的增加而增加
• 比表面积越大，保留值越大 • 键合碳链越长，保留越大
C18 ≈ C8>C3>C1，长链之间差别不大
反相键合相的保留行为
拖尾峰 T0（尿嘧啶）
不同厂家色谱柱的 保留值，选择性与峰型 色谱柱：4.6*150mm， 流动相：乙腈－0.05M 磷酸钾缓冲液， pH3.2(65:35);流速： 1ml/min，
Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅 烷）水解/烧结/酸洗
杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱
柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II
硅胶纯度－金属含量
d
固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响
残余硅羟基的影响
普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟 基会带负电荷，碱性化合物拖尾。
R-Si(CH3)2-X
OH
Si O Si O Si O Si OH
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si OH
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si OH
OH
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
峰对称性《 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积《 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键
合类型；流动相，温度 灵敏度《 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性《 基质表面特性，键合类型；流动相，温
度
流动相 《 pH，缓冲盐种类，溶剂；
影响色谱柱性能的主要因素
Saponins Extract
Zorbax SB C18
ASB C18
4.6x150 mm column, 1% formic acid/MeOH= 80/20
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
0.01 ng/mL Pseudoephedrine
Agela Venusil ASB C18, 2.1×50mm, 5µm
柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径
硅胶粒径和类型对柱效的影响
硅胶粒径和类型对压力的影响
d
柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II
目前市场主要可供选择的填料粒径
• 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 • 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) • 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 • 5.0μm － 常规分析
色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）
；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混
合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检 测器（流通池）
分离度
Rs ( N ) • ( a 1) • ( k )
4
a k 1
TF=1.69
30
20
！TF=？
10
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 min
0
2
4
6
8
10
min
流动相： 甲醇：水=65：35
流速：
1 mL/min
温度：
35℃
检测波长： 230 nm
进样量： 20 μL
硅胶基质类型及发展史
Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量， 高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091202.D)
Brand U,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091711.D)
2.899
3.944
25
40
20 15
A5r.ea9:31476.686
1、 色谱柱的构型 • 色谱柱内径 • 色谱柱长度
2、 固定相柱填料 • 粒径 • 比表面积 • 孔径 • 孔隙率 • 基质表面特性： - 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 • 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径 色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：
1.5ml/min
由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大
柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I
硅胶纯度－金属含量
OH OH
OH
2.3-二羟基萘
HO
2.7-二羟基萘
Venusil MP C18 5μm, 4.6mm×150mm Brand H, C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
硅胶双层表面修饰后 • 新增加表面层硅羟基活性更低－新硅羟基pH=5.2， 普通硅
羟基pH约为3.5 更对称的峰型，提高柱效，提高灵敏度
• 硅胶表面更均匀－硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖
重现性更好
• 表面纯度更高－硅胶金属杂质被覆盖
极性化合物保留和分离更好
键性化合物峰形对比
C18 (non-endcapped, twin-layer
液相色谱柱的选择和方法开发
天津博纳艾杰尔科技/Agela Technologies （US）
内容概要
色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发 制备液相 混合固定相----优化复杂样品分离的一个新策
略 如何改善强水溶性化合物的保留和分离
色谱基本概念回顾
ห้องสมุดไป่ตู้
色谱（chromatography）
O CH3 Si O CH3 O CH3
Hydrolysis
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R OH
ＬＯＤ：Limit of Detection ＬＯＱ：Limit of Quantification
－ 柱效 －峰形（拖尾因子）
重现性
分离度（Ｒ） －保留时间（Ｖ，Ｔ，Ｋ） －选择性（ α） －柱效 （Ｎ）
灵敏度
色谱柱类型、选择和方法开发
色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响
分离度《 - 选择性 〈 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 - 柱效 〈 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速
2.275 253.288
Area:
2.450 3.471
3.008 4.084
40
50 40
35
30
TF=1.31
30
TF=1.42
40
25
30
20
20
20
15
10
10
10
A2r.ea8:84900.399
TF=1.39
5
0
0 0
0
1
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5
6
7
min
0
1
2
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7
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0
1
2
3
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5
6
min
Brand Z,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
• Rs - Resolution • N – Theoretical Plate Number •α– Selectivity • k – Retention Factor •拖尾
幻灯片制作：WSY18
1.Separation of Compounds A and B
幻灯片制作：WSY18
灵敏度
解决方法
封尾 双层表面修饰 表面杂化
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
封尾
键合填料与小硅烷进行后续反应，如三 甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，
以增加表面覆盖率。
缺点：
TMS
不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被 反应） 在pH<3时，TMS易流失，耐用性，稳定 性不好
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
样品分子直径小于平均孔 径，才能进入微粒内部
孔径至少是样品流体学直 径的4倍
300Ǻ孔径用于：超过50个 氨基酸的肽或25个残基的低 聚寡核苷酸
样品分子直径小于平均孔径， 才能进入微粒内部
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II
条件： C8色谱柱，4.6×150mm， 3.5um，
A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－
不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
双层表面修饰
降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀
Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H
Brand A C18 2.1×50mm, 5µm
Phenomenex Luna C18, 2.0×50mm, 5µm
双层表面修饰
代表产品：
Venusil MP C18， Venusil ASB C18， Venusil HILIC
固定相对色谱柱性能的影响：键合类型
A 纵向交联：保留和选择不稳定 B 横向交联：宽pH适用，Durashell，Gemini C 单体键合：重现性好，柱效高 D 单体（空间保护）：低pH稳定（Zorbax SB，Venusil ASB） Ｅ极性官能团嵌合反相固定相 ( Zorbax Bonus RP, Venusil HLP)
P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺 B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯
固定相对色谱柱性能的影响：
基质表面特性+键合类型 〉键合相的稳定性
键合相的稳定性 • 低pH值，键合相流失
• 高pH值，硅胶溶解
影响色谱柱寿命，方法不重现
键合类型对键合相稳定性影响
低pH值，键合相流失
键合类型对键合相稳定性影响（II）
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 • 窄径柱 ( 2.1mm) – 满足检测器和样品量限制 • 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命
制备柱 (内径> 10 mm) – 用于纯化制备
柱填料对色谱柱性能的影响
空间位阻保护，延缓键合相流失
空间位阻键合代表产品： Venusil ASB C18 Zorbax SB C18
固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性
高pH值，硅胶基质溶解
pH9时，色谱柱的稳定性
固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性
碳杂化，延硅胶缓高pH值水解
表面碳杂化 Agela Durashell RP Phenomenex Gemini
Brand A C18( nonendcapped, )
Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6) = 70/30 Temperature: 30 oC Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm
Brand W, AQ Column 5μm, 4.6mm×150mm
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091702.D)
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091208.D)
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07090605.D)
杂化颗粒： Waters Xterra
表面碳杂化示意图
pH=12 条件下的稳定性
4 amines, ACN/ 1% Ammonia aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x 150 mm, 5um
CH3 O H3C O Si O CH3 O CH3
O CH3
Si O Si O Si O Si O CH3
OOO
O CH3
Si O Si O Si O H
OOO
O CH3
Si O Si O Si O Si O CH3
OOO
O CH3
Si O Si O Si O H
OOO Si O Si O Si O
颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高.
柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积
每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间
增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I
多孔材料的95%以上表面 在孔内部
固定相对色谱柱性能的影响：
基质表面特性+键合类型 〉反相键合相的保留行为
同一厂家相同硅胶基质的反相柱：
• 保留值随含碳量的增加而增加
• 比表面积越大，保留值越大 • 键合碳链越长，保留越大
C18 ≈ C8>C3>C1，长链之间差别不大
反相键合相的保留行为
拖尾峰 T0（尿嘧啶）
不同厂家色谱柱的 保留值，选择性与峰型 色谱柱：4.6*150mm， 流动相：乙腈－0.05M 磷酸钾缓冲液， pH3.2(65:35);流速： 1ml/min，
Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅 烷）水解/烧结/酸洗
杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱
柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II
硅胶纯度－金属含量
d
固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响
残余硅羟基的影响
普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟 基会带负电荷，碱性化合物拖尾。
R-Si(CH3)2-X
OH
Si O Si O Si O Si OH
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si OH
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si OH
OH
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
峰对称性《 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积《 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键
合类型；流动相，温度 灵敏度《 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性《 基质表面特性，键合类型；流动相，温
度
流动相 《 pH，缓冲盐种类，溶剂；
影响色谱柱性能的主要因素
Saponins Extract
Zorbax SB C18
ASB C18
4.6x150 mm column, 1% formic acid/MeOH= 80/20
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
0.01 ng/mL Pseudoephedrine
Agela Venusil ASB C18, 2.1×50mm, 5µm
柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径
硅胶粒径和类型对柱效的影响
硅胶粒径和类型对压力的影响
d
柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II
目前市场主要可供选择的填料粒径
• 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 • 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) • 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 • 5.0μm － 常规分析
色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）
；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混
合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检 测器（流通池）
分离度
Rs ( N ) • ( a 1) • ( k )
4
a k 1
TF=1.69
30
20
！TF=？
10
10
5
0
0
1
2
3
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9 min
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8
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min
流动相： 甲醇：水=65：35
流速：
1 mL/min
温度：
35℃
检测波长： 230 nm
进样量： 20 μL
硅胶基质类型及发展史
Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量， 高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091202.D)
Brand U,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091711.D)
2.899
3.944
25
40
20 15
A5r.ea9:31476.686
1、 色谱柱的构型 • 色谱柱内径 • 色谱柱长度
2、 固定相柱填料 • 粒径 • 比表面积 • 孔径 • 孔隙率 • 基质表面特性： - 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 • 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径 色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：