核酸药物和制药技术
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siRNA的作用 体外实验和动物模型研究证明siRNA药物可以成功抑制HIV、乙肝 病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒等的感染。 siRNA还可以治疗一些非感染性疾病：美国正在开发一种治疗老 年性黄斑变性的siRNA药物
siRNA药物临床研 究进展.doc
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Ⅰ启动阶段 Ⅱ执行阶段
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RNAi的作用原理
启动阶段 当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞中一 种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成2123bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合 体，构成“RNA诱导的沉默小体”
与mRNA结合，封闭核糖体结合位点，影响翻译
与mRNA形成dsRNA，诱导RNase H对其降解 与互补DNA结合，形成DNA-RNA复合物， 影响DNA复制
特点
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❖ 双链RNA（如siRNA ）作用强烈； ❖ 与核酶连接作用更强。
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体T7、SP6等启动子的表达质粒
正义链 反义链
混合 双链RNA Dicer酶加工
siRNA
大规模的化学合成方法： 可以在合成时加入保护基 团增加siRNA的稳定性
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核酸药物的修饰和给药
人体内存在大量的核酸酶，在体内应用反义RNA，siRNA等新型核 酸药物治疗时，一个关键问题就是保证它们能够抵抗核酸酶的降解 并被有效地运输到靶细胞。RNA的化学修饰是一个有效的途径
天然锤头状核酶示意图
5′
底物位点 CCUGUCACCGGA U
G
U
G
3′ GGACA UGGCCU
A CU
UUU
A
G源自文库
G C
GA G
A U
AU
催化活性位点
GC
GC AG
UU
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反义核苷酸药物的应用
反义核酸技术在实验室中取得了较好的效果，90年代以来国外一些制 药公司开展了若干反义药物的临床实验。 1997年，美国Genta公司研制了针对Bcl2基因的反义药物，用于治疗 前列腺癌和其他恶性肿瘤。 美国Hybridon公司研制了针对巨细胞病毒（CMV）感染的反义药物 并进行了临床实验。
化 修饰磷酸二酯键
学 修
修饰核酸
饰
修饰骨架
邓子新《Nature Chemical Biology》 2007.
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
核酸药物的修饰和给药
增强核酸药物有效运送到靶组织的方式： Ⅰ 用脂质体等材料包埋核酸药物静脉注射。如果在脂质体上加
入有助于膜融合的分子如氯喹，可以进一步提高它们进入细胞的效 率
Tom Tuschl根据实验提出了一个设计siRNA的原则： 选择转译起始密码子后50-100碱基的范围，以AA作为正义
链的第1，2个核苷酸，GC比为50﹪左右，同时在正义链和反义 链的3′-都有TT两个核苷酸的突变
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siRNA的设计和制备
siRNA的制备
实验室制法： 构建目标基因两侧分别带有噬菌 体外转录
靶向Livin反义核 酸诱导肝癌HepG2细胞凋亡并提高其对卡铂.doc
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RNA干扰药物
RNA干扰（RNA interference，RNAi） 是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程 ，其广泛存 在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。
RNAi的作用原理 双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段：
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siRNA的设计和制备
siRNA的制备
实验室制法： 构建目标基因两侧分别带有噬菌
体T7、SP6等启动子的表达质粒
体外转录
正义链 反义链
混合 双链RNA Dicer酶加工
siRNA
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siRNA的设计和制备
siRNA的设计 应选取对于疾病发生具有至关重要作用，而对细 胞的其他功能影响不大的保守基因作为目标基因，再根据目标基 因的序列设计siRNA
（21-23bp）
RISC前体
RISC
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执行阶段原理图
执行阶段
mRNA
RISC 切割
AAAAAAA
AAAAAAA
胞内其它
核酸酶切割
siRNA药物
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长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，干扰素又会抑制细胞 的蛋白质合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小双 链RNA即siRNA，则不会诱导干扰素反应，却能在细胞中激活 RISC，发挥抑制基因表达的作用。
siRNA药物优点与缺点
优点：与反义RNA相似，siRNA作为药物具有目标基因专一 性强 与反义RNA相比，siRNA药物的作用机制更加明确， 效果更加肯定
缺点：siRNA的作用需要与目标RNA间发生完全的配对，因 此对于目标RNA的突变很敏感。个别位点的突变会使 效果大打折扣 在用于抗病毒治疗时，病毒可能出现抗药突变株
（RNA-induced silencing complex，RISC）
执行阶段 当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时， RISC就 会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目 标基因的表达
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启动阶段原理图
启动阶段
Dicer
siRNA
反义核酸
反义RNA分子 ： 可以和目标基因的mRNA互补的
一段寡聚核苷酸分子，它影响mRNA正常功能； 反
义 反义DNA分子： 类似于反义RNA分子，可以抑制基
核 酸
因表达的分子；
RNA-DNA嵌合分子：
经化学修饰的寡聚核苷酸类似物：Oligo
作用机理
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与前体RNA结合－干扰RNA剪切和成熟
核酶（Ribozyme)
核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980年 Cech在嗜热四膜虫中首先发现。
目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种 1. 发卡状核酶 2. 锤头状核酶 3. Ⅰ型内含子核酶 4. RNaseP核酶 5. 丁型肝炎病毒核酶
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Ⅰ启动阶段 Ⅱ执行阶段
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RNAi的作用原理
启动阶段 当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞中一 种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成2123bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合 体，构成“RNA诱导的沉默小体”
与mRNA结合，封闭核糖体结合位点，影响翻译
与mRNA形成dsRNA，诱导RNase H对其降解 与互补DNA结合，形成DNA-RNA复合物， 影响DNA复制
特点
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❖ 双链RNA（如siRNA ）作用强烈； ❖ 与核酶连接作用更强。
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体T7、SP6等启动子的表达质粒
正义链 反义链
混合 双链RNA Dicer酶加工
siRNA
大规模的化学合成方法： 可以在合成时加入保护基 团增加siRNA的稳定性
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核酸药物的修饰和给药
人体内存在大量的核酸酶，在体内应用反义RNA，siRNA等新型核 酸药物治疗时，一个关键问题就是保证它们能够抵抗核酸酶的降解 并被有效地运输到靶细胞。RNA的化学修饰是一个有效的途径
天然锤头状核酶示意图
5′
底物位点 CCUGUCACCGGA U
G
U
G
3′ GGACA UGGCCU
A CU
UUU
A
G源自文库
G C
GA G
A U
AU
催化活性位点
GC
GC AG
UU
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反义核苷酸药物的应用
反义核酸技术在实验室中取得了较好的效果，90年代以来国外一些制 药公司开展了若干反义药物的临床实验。 1997年，美国Genta公司研制了针对Bcl2基因的反义药物，用于治疗 前列腺癌和其他恶性肿瘤。 美国Hybridon公司研制了针对巨细胞病毒（CMV）感染的反义药物 并进行了临床实验。
化 修饰磷酸二酯键
学 修
修饰核酸
饰
修饰骨架
邓子新《Nature Chemical Biology》 2007.
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
核酸药物的修饰和给药
增强核酸药物有效运送到靶组织的方式： Ⅰ 用脂质体等材料包埋核酸药物静脉注射。如果在脂质体上加
入有助于膜融合的分子如氯喹，可以进一步提高它们进入细胞的效 率
Tom Tuschl根据实验提出了一个设计siRNA的原则： 选择转译起始密码子后50-100碱基的范围，以AA作为正义
链的第1，2个核苷酸，GC比为50﹪左右，同时在正义链和反义 链的3′-都有TT两个核苷酸的突变
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
siRNA的设计和制备
siRNA的制备
实验室制法： 构建目标基因两侧分别带有噬菌 体外转录
靶向Livin反义核 酸诱导肝癌HepG2细胞凋亡并提高其对卡铂.doc
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
RNA干扰药物
RNA干扰（RNA interference，RNAi） 是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程 ，其广泛存 在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。
RNAi的作用原理 双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段：
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
siRNA的设计和制备
siRNA的制备
实验室制法： 构建目标基因两侧分别带有噬菌
体T7、SP6等启动子的表达质粒
体外转录
正义链 反义链
混合 双链RNA Dicer酶加工
siRNA
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
siRNA的设计和制备
siRNA的设计 应选取对于疾病发生具有至关重要作用，而对细 胞的其他功能影响不大的保守基因作为目标基因，再根据目标基 因的序列设计siRNA
（21-23bp）
RISC前体
RISC
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
执行阶段原理图
执行阶段
mRNA
RISC 切割
AAAAAAA
AAAAAAA
胞内其它
核酸酶切割
siRNA药物
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，干扰素又会抑制细胞 的蛋白质合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小双 链RNA即siRNA，则不会诱导干扰素反应，却能在细胞中激活 RISC，发挥抑制基因表达的作用。
siRNA药物优点与缺点
优点：与反义RNA相似，siRNA作为药物具有目标基因专一 性强 与反义RNA相比，siRNA药物的作用机制更加明确， 效果更加肯定
缺点：siRNA的作用需要与目标RNA间发生完全的配对，因 此对于目标RNA的突变很敏感。个别位点的突变会使 效果大打折扣 在用于抗病毒治疗时，病毒可能出现抗药突变株
（RNA-induced silencing complex，RISC）
执行阶段 当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时， RISC就 会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目 标基因的表达
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
启动阶段原理图
启动阶段
Dicer
siRNA
反义核酸
反义RNA分子 ： 可以和目标基因的mRNA互补的
一段寡聚核苷酸分子，它影响mRNA正常功能； 反
义 反义DNA分子： 类似于反义RNA分子，可以抑制基
核 酸
因表达的分子；
RNA-DNA嵌合分子：
经化学修饰的寡聚核苷酸类似物：Oligo
作用机理
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
与前体RNA结合－干扰RNA剪切和成熟
核酶（Ribozyme)
核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980年 Cech在嗜热四膜虫中首先发现。
目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种 1. 发卡状核酶 2. 锤头状核酶 3. Ⅰ型内含子核酶 4. RNaseP核酶 5. 丁型肝炎病毒核酶
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。