丝状真菌表达系统在thaumatin 基因工程中的优化
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丝状真菌作为转化的宿主菌 ,有许多其他微生 物如细菌 、酵母等不可比拟的优点 :1) 丝状真菌具 有很强的分泌胞外蛋白的能力 ,而细菌表达的重组 蛋白往往以无活性的 、难溶的包含体形式存在 ;2) 当细菌表达外源真核基因时 ,因其翻译和转录不同 于真核生物 ,因此即便真核基因转入细菌 ,也有可 能不表达 ,但丝状真菌不存在类似的情况 ;3) 丝状 真菌能对表达蛋白进行正确的翻译后加工 ,包括肽 链的剪切和糖基化等翻译后加工 ;4) 丝状真菌具有 像细菌一样的快速繁殖能力和短的生活周期 ,比动 植物的细胞培养要简单 ;5) 许多丝状真菌 ,如黑曲 霉 ( Aspergillus niger) 、米曲霉 ( Aspergillus oryzae) 等长 期被用在食品工业 ,被公认是安全的 ;6) 丝状真菌 具有成熟的发酵工艺和后处理工艺 。由此可以看 出 ,丝状真菌是一个具有吸引力的 (attractive) [3] 异
2 增加基因的拷贝数
增加外源基因在丝状真菌中的拷贝数 ,能显著 增加重组蛋白的表达产量 。Moralejo F. J [4] 通过构 建不同的 thaumatin 基因表达载体 ,在 A . awamori 中 表达 ,发现 thaumatin 产量与一定量的 thaumatin 基 因拷贝数成线性关系 。但当拷贝数达到一定数量 时 ,thaumatin 的产量不再上升 ,这可能是外泌途径 的超载引起了蛋白的异常折叠和降解 。
3 利用蛋白酶缺陷株或抑制蛋白酶 的活性
丝状真菌自身能产生一些蛋白酶 ,这些蛋白酶 或位于细胞内 ,或分泌到胞外 。他们能降解丝状真 菌产 生 的 thaumatin , 引 起 thaumatin 产 量 下 降 , 是 thaumatin 生产的一大障碍 。为了克服这一困难 ,在 丝状真菌基因工程中 ,往往采用遗传诱变或插入失 活的方法得到一些蛋白酶缺陷的丝状真菌株 。利
丝状真菌启动子具有种属特异性 。Moralejo F. J [4] 发 现 , 用 P. chrysogenum 的 pcbC 启 动 子 或 A. chrysogenum 的 B2 启动子构建不同的表达盒在 A. awamori 中 表 达 时 , 表 达 产 量 分 别 为 717 mgΠL 和 116 mgΠL ,相反 ,如果换用 Aspergillus 的启动子时 , 表达产量能达到 11 mgΠL 。推测这可能和特异性转 录因子有关 。
Thaumatin[1 ,2] 是一种超甜蛋白 ,它是从一种西 非植物 Thaumatococcus daniellii Benth 的果实中分离 出来的 。它无毒 、安全 、多食不会引起肥胖和龋齿 , 是最有希望替代蔗糖的甜味剂 。但由于 Thaumato2 coccus daniellii Benth 的生长条件极其苛刻 ,使得通 过 Thaumatococcus daniellii 提取 thaumatin 变得十分 困难 ,于是人们便把希望寄托在 thaumatin 的基因工 程上 。迄今为止 ,人们已利用了数十种微生物去生 产 thaumatin ,但结果令人十分沮丧 ,得到的表达产 物不仅产量低 ,而且没有活性 ,人们又把目光投向 了新的表达系统 。
用这些缺陷株去生产重组 thaumatin ,能很大程度上 降低表达产物被降解的可能性 。Moralejo F. J 等 人[5] 在 A . awamori 的蛋白酶基因 aspergillopepsin A 基因中插入一段 200 bp 的序列 ,得到 pepA 缺陷株 , 利用它作宿主 ,表达 thaumatin ,发现产量比野生型 的高 7～20 倍左右 。此外通过控制丝状真菌培养 条件 ,抑制丝状真菌外泌蛋白酶的活性 ,也能达到 提高表达产物产量的目的 。
5 优化反应条件
在丝状真菌生产 thaumatin 过程中 ,培养条件的 优化往往能使 thaumatin 产量提高 。丝状真菌的培 养过程分菌丝体生长阶段和蛋白质分泌阶段 。为 了延长 thaumatin 的表达时间 ,提高 thaumatin 的产 量 ,在构建 thaumatin 基因表达载体时 ,往往采用双 价载体 ,即两个 thaumatin 基因表达盒串联 ,在每一 个 thaumatin 基因前均有一个启动子 ,这两个启动子 在丝状真菌培养过程的不同阶段进行表达调控 。 这样 ,就能延长 thaumatin 表达时间 ,提高 thaumatin 表达产量 。GdhA 启动子在菌丝体生长的早期表 达 ,而 B2 启动子主要是在菌丝体生长期快完成时 表达 。Moralejo F. J [4] 利用这两个启动子构建双价 载体表达 thaumatin ,发现产量有很大提高 。
在融合基因中 ,内源基因与 thaumatin 基因的连 接处往往加上丝状真菌内肽酶的识别位点便可实 现 thaumatin 与内源蛋白的分离 ,容易地得到 thau2 matin 。在丝状真菌中含有一种与酵母 KEX22 类似 的蛋白酶 ,他可以识别和剪切暴露的 Lys2Arg ,Arg2 Arg 和 Arg2Lys 位点[6] 。
2003 年 9 月 第 17 卷第 3 期总 53 期
北京联合大学学报 (自然科学版) Journal of Beijing Union University(Natural Sciences)
Sep . 2003 Vol. 17 No. 3 Sum No. 53
丝状真菌表达系统在 thaumatin 基因工程中的优化
源基因表达系统 。尤其是近年来 ,随着丝状真菌转 化技术的迅猛发展 ,许多丝状真菌被应用到工业 、 农业 、医药行业中 ,生产出了许多真菌或非真菌来 源的重组蛋白 ,如葡糖淀粉酶 (glucoamylase) 、牛凝 乳酶原 (bovine chymosin) 、人体乳铁蛋白 (human lact2 oferrin) 、鸡蛋清溶菌酶 ( hen egg - white lysozyme) 和 人体白细胞介素 6 ( human interleukin - 6) 等 。由于 在其他微生物中生产 thaumatin 不是很成功 ,因此人 们便尝试用丝状真菌去生产 thaumatin 。从 20 世纪 90 年代至今 ,利用丝状真菌生产 thaumatin 取得了 前所未有的成功 ,丝状真菌表达系统在 thaumatin 基 因工程中日趋优化 ,发展到今天 ,利用丝状真菌生 产 thaumatin 正成为一个新的研究领域 。
第 17 卷第 3 期
裴凌鹏等 :丝状真菌表达系统在 thaumatin 基因工程中的优化
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量下降 30 % ;相反 ,如果每隔一段时间往培养物中 加入 一 定 的 蔗 糖 , 则 会 使 thaumatin 的 产 量 上 升 40 %[5] 。加入诱导物如 (NH4 ) 2 SO4 、L2Asn 等能诱导 真菌启动子的表达 ,但正如前所述 ,诱导物对启动 子的诱导具有选择性 。培养物的 pH 在 610 以上 时 ,一些酸性蛋白酶如 aspergillopepsin B 失活 ,而这 些蛋白酶是能降解 thaumatin 的 。但 pH 高于 615 后 ,thaumatin 的分泌反而减少 ,推测这可能与跨膜 质子梯度减少有关[5] 。
在菌丝体生长阶段 ,加入葡萄糖可使菌丝体量 达到最大值 ,而在后阶段为了最大程度地收获表达 产物 ,则需在培养物中加入蔗糖和诱导物 ,且培养 物必须保持低的 pH 值 。加蔗糖的目的是为了抑制 蛋白酶基因的表达 。研究结果表明 ,如果在培养物 中用蔗糖和葡萄糖混合物代替蔗糖 ,则 thaumatin 产
短短十几年时间 ,利用丝状真菌生产 thauma2 tin ,产量从几毫克每升上升到一百多毫克每升 ,这 和丝状真菌表达系统在 thaumatin 基因工程上的优 化不无关系 。丝状真菌表达系统的优化包括选用 强启动子 、增加基因拷贝数 、利用蛋白酶缺陷株 、进 行基因融合 、优化反应条件等 ,下面将分别叙述 。
6 蛋白的分泌
影响 thaumatin 产量的瓶颈是蛋白的外泌[4] 。 蛋白质的分泌路径是涉及到在几个细胞器中进行 的复杂系统 。尽管现在对于分泌路径的研究主要 限于哺乳动物和酵母 ,但超微电镜研究表明丝状真 菌与酵母 、哺乳动物的细胞并无本质区别 。因此 ,
真菌启动子也具有诱导特异性 ,在真菌重组子 培养液中加入适当的诱导物 ,异源蛋白的表达产量 会 显 著 提 高 。Moralejo F. J [5] 实 验 表 明 , 当 用 (NH4 ) 2 SO4 诱导 gdhA 启动子时 ,由 gdhA 启动子调 控表达的 thaumatin 能达到 105 mgΠL ;同样 ,当用 L2 Asn 诱导 cahB 启动子时 ,由 cahB 启动子调控表达 的 thaumatin 也能达到同样的产量 ,但当 (NH4 ) 2 SO4 去诱导 cahB 启动子时 ,由 cahB 调控表达的 thauma2 tin 产量只有 76 mgΠL 。
裴凌鹏1 , 孔建强2 , 赵 琦2
(1 北京联合大学 应用文理学院 ,北京 100083 ; 2 首都师范大学 生物系 , 北京 100037)
[ 摘 要 ] 在 thaumatin 重组生产中 ,丝状真菌是最成功的表达系统 ,十几年来 ,为了最大程度地 获得重组 thaumatin ,人们对丝状真菌表达系统进行了各种优化 ,如选用特异性强启动子 、增加基因 拷贝数 、利用蛋白酶缺陷株 、进行基因融合 、优化反应条件等 。随着丝状真菌表达系统的优化 ,重 组 thaumatin 的产量也随之提高 。 [ 关键词 ] 丝状真菌 ;表达系统 ;启动子 ;优化 [ 中图分类号 ] Q 503 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 100520310 (2003) 0320075203
[ 收稿日期 ] 2003 - 04 - 10 [作者简介 ] 裴凌鹏 (1976 —) ,男 ,北京市人 ,北京联合大学应用文理学院助教 ,理学硕士 ,从事食品生物技术 、基因工 程 、分子细胞生物学教学与研究 。
Fra Baidu bibliotek
76
北京联合大学学报 (自然科学版)
2003 年 9 月
awamori) 谷氨酸脱氢酶基因 (glutamate dehydrogenase gene ,gdhA) 的启动子 ,产黄青霉 ( penicillium chrysoge2 num) 异青霉素 N - 合酶基因 (isopenicillin N2synthase gene) 的启动子 , Acremonium chrysogenum B2 宽光谱 脂酶基因 (B2 wide2spectrum esterase gene ,cesB) 的启 动子等 。1999 年 ,Moralejo F. J 等人[4] 利用 gdhA 启 动子 、gpdA 启动子构建不同的 thaumatin 基因表达 盒 ( express cassette ) , 转 入 丝 状 真 菌 Aspergillus awamori 中 ,得到的 thaumatin 不仅有甜味 ,而且表达 产量也比在其他微生物中的高 。
1 启动子
用强的启动子能增加外源基因在丝状真菌中 的表达产量 ,而这些强的启动子均来自高效表达的 丝状真菌基因 。如构巢曲霉 ( Aspergillus nidulas) 甘 油醛 - 3 - 磷 酸 脱 氢 酶 ( glyceraldehyde232phosphate dehydrogenase, gpdA) 的 启 动 子 , 泡 盛 酒 曲 酶 ( A .
4 基因融合
为了防止重组 thaumatin 被降解 ,提高 thaumatin 的分泌效率 ,在丝状真菌表达系统中往往采用基因 融合的方式 ,即把一个在丝状真菌中能高效表达的 基因截短 ,与 thaumatin 基因融合 ,构建成载体 ,在丝 状真菌中进行表达 。Faus I[3] 和 Moralejo F. J [4] 分别 在丝状真菌中对 thaumatin 进行融合表达 ,得到的产 量比较高 。
2 增加基因的拷贝数
增加外源基因在丝状真菌中的拷贝数 ,能显著 增加重组蛋白的表达产量 。Moralejo F. J [4] 通过构 建不同的 thaumatin 基因表达载体 ,在 A . awamori 中 表达 ,发现 thaumatin 产量与一定量的 thaumatin 基 因拷贝数成线性关系 。但当拷贝数达到一定数量 时 ,thaumatin 的产量不再上升 ,这可能是外泌途径 的超载引起了蛋白的异常折叠和降解 。
3 利用蛋白酶缺陷株或抑制蛋白酶 的活性
丝状真菌自身能产生一些蛋白酶 ,这些蛋白酶 或位于细胞内 ,或分泌到胞外 。他们能降解丝状真 菌产 生 的 thaumatin , 引 起 thaumatin 产 量 下 降 , 是 thaumatin 生产的一大障碍 。为了克服这一困难 ,在 丝状真菌基因工程中 ,往往采用遗传诱变或插入失 活的方法得到一些蛋白酶缺陷的丝状真菌株 。利
丝状真菌启动子具有种属特异性 。Moralejo F. J [4] 发 现 , 用 P. chrysogenum 的 pcbC 启 动 子 或 A. chrysogenum 的 B2 启动子构建不同的表达盒在 A. awamori 中 表 达 时 , 表 达 产 量 分 别 为 717 mgΠL 和 116 mgΠL ,相反 ,如果换用 Aspergillus 的启动子时 , 表达产量能达到 11 mgΠL 。推测这可能和特异性转 录因子有关 。
Thaumatin[1 ,2] 是一种超甜蛋白 ,它是从一种西 非植物 Thaumatococcus daniellii Benth 的果实中分离 出来的 。它无毒 、安全 、多食不会引起肥胖和龋齿 , 是最有希望替代蔗糖的甜味剂 。但由于 Thaumato2 coccus daniellii Benth 的生长条件极其苛刻 ,使得通 过 Thaumatococcus daniellii 提取 thaumatin 变得十分 困难 ,于是人们便把希望寄托在 thaumatin 的基因工 程上 。迄今为止 ,人们已利用了数十种微生物去生 产 thaumatin ,但结果令人十分沮丧 ,得到的表达产 物不仅产量低 ,而且没有活性 ,人们又把目光投向 了新的表达系统 。
用这些缺陷株去生产重组 thaumatin ,能很大程度上 降低表达产物被降解的可能性 。Moralejo F. J 等 人[5] 在 A . awamori 的蛋白酶基因 aspergillopepsin A 基因中插入一段 200 bp 的序列 ,得到 pepA 缺陷株 , 利用它作宿主 ,表达 thaumatin ,发现产量比野生型 的高 7～20 倍左右 。此外通过控制丝状真菌培养 条件 ,抑制丝状真菌外泌蛋白酶的活性 ,也能达到 提高表达产物产量的目的 。
5 优化反应条件
在丝状真菌生产 thaumatin 过程中 ,培养条件的 优化往往能使 thaumatin 产量提高 。丝状真菌的培 养过程分菌丝体生长阶段和蛋白质分泌阶段 。为 了延长 thaumatin 的表达时间 ,提高 thaumatin 的产 量 ,在构建 thaumatin 基因表达载体时 ,往往采用双 价载体 ,即两个 thaumatin 基因表达盒串联 ,在每一 个 thaumatin 基因前均有一个启动子 ,这两个启动子 在丝状真菌培养过程的不同阶段进行表达调控 。 这样 ,就能延长 thaumatin 表达时间 ,提高 thaumatin 表达产量 。GdhA 启动子在菌丝体生长的早期表 达 ,而 B2 启动子主要是在菌丝体生长期快完成时 表达 。Moralejo F. J [4] 利用这两个启动子构建双价 载体表达 thaumatin ,发现产量有很大提高 。
在融合基因中 ,内源基因与 thaumatin 基因的连 接处往往加上丝状真菌内肽酶的识别位点便可实 现 thaumatin 与内源蛋白的分离 ,容易地得到 thau2 matin 。在丝状真菌中含有一种与酵母 KEX22 类似 的蛋白酶 ,他可以识别和剪切暴露的 Lys2Arg ,Arg2 Arg 和 Arg2Lys 位点[6] 。
2003 年 9 月 第 17 卷第 3 期总 53 期
北京联合大学学报 (自然科学版) Journal of Beijing Union University(Natural Sciences)
Sep . 2003 Vol. 17 No. 3 Sum No. 53
丝状真菌表达系统在 thaumatin 基因工程中的优化
源基因表达系统 。尤其是近年来 ,随着丝状真菌转 化技术的迅猛发展 ,许多丝状真菌被应用到工业 、 农业 、医药行业中 ,生产出了许多真菌或非真菌来 源的重组蛋白 ,如葡糖淀粉酶 (glucoamylase) 、牛凝 乳酶原 (bovine chymosin) 、人体乳铁蛋白 (human lact2 oferrin) 、鸡蛋清溶菌酶 ( hen egg - white lysozyme) 和 人体白细胞介素 6 ( human interleukin - 6) 等 。由于 在其他微生物中生产 thaumatin 不是很成功 ,因此人 们便尝试用丝状真菌去生产 thaumatin 。从 20 世纪 90 年代至今 ,利用丝状真菌生产 thaumatin 取得了 前所未有的成功 ,丝状真菌表达系统在 thaumatin 基 因工程中日趋优化 ,发展到今天 ,利用丝状真菌生 产 thaumatin 正成为一个新的研究领域 。
第 17 卷第 3 期
裴凌鹏等 :丝状真菌表达系统在 thaumatin 基因工程中的优化
77
量下降 30 % ;相反 ,如果每隔一段时间往培养物中 加入 一 定 的 蔗 糖 , 则 会 使 thaumatin 的 产 量 上 升 40 %[5] 。加入诱导物如 (NH4 ) 2 SO4 、L2Asn 等能诱导 真菌启动子的表达 ,但正如前所述 ,诱导物对启动 子的诱导具有选择性 。培养物的 pH 在 610 以上 时 ,一些酸性蛋白酶如 aspergillopepsin B 失活 ,而这 些蛋白酶是能降解 thaumatin 的 。但 pH 高于 615 后 ,thaumatin 的分泌反而减少 ,推测这可能与跨膜 质子梯度减少有关[5] 。
在菌丝体生长阶段 ,加入葡萄糖可使菌丝体量 达到最大值 ,而在后阶段为了最大程度地收获表达 产物 ,则需在培养物中加入蔗糖和诱导物 ,且培养 物必须保持低的 pH 值 。加蔗糖的目的是为了抑制 蛋白酶基因的表达 。研究结果表明 ,如果在培养物 中用蔗糖和葡萄糖混合物代替蔗糖 ,则 thaumatin 产
短短十几年时间 ,利用丝状真菌生产 thauma2 tin ,产量从几毫克每升上升到一百多毫克每升 ,这 和丝状真菌表达系统在 thaumatin 基因工程上的优 化不无关系 。丝状真菌表达系统的优化包括选用 强启动子 、增加基因拷贝数 、利用蛋白酶缺陷株 、进 行基因融合 、优化反应条件等 ,下面将分别叙述 。
6 蛋白的分泌
影响 thaumatin 产量的瓶颈是蛋白的外泌[4] 。 蛋白质的分泌路径是涉及到在几个细胞器中进行 的复杂系统 。尽管现在对于分泌路径的研究主要 限于哺乳动物和酵母 ,但超微电镜研究表明丝状真 菌与酵母 、哺乳动物的细胞并无本质区别 。因此 ,
真菌启动子也具有诱导特异性 ,在真菌重组子 培养液中加入适当的诱导物 ,异源蛋白的表达产量 会 显 著 提 高 。Moralejo F. J [5] 实 验 表 明 , 当 用 (NH4 ) 2 SO4 诱导 gdhA 启动子时 ,由 gdhA 启动子调 控表达的 thaumatin 能达到 105 mgΠL ;同样 ,当用 L2 Asn 诱导 cahB 启动子时 ,由 cahB 启动子调控表达 的 thaumatin 也能达到同样的产量 ,但当 (NH4 ) 2 SO4 去诱导 cahB 启动子时 ,由 cahB 调控表达的 thauma2 tin 产量只有 76 mgΠL 。
裴凌鹏1 , 孔建强2 , 赵 琦2
(1 北京联合大学 应用文理学院 ,北京 100083 ; 2 首都师范大学 生物系 , 北京 100037)
[ 摘 要 ] 在 thaumatin 重组生产中 ,丝状真菌是最成功的表达系统 ,十几年来 ,为了最大程度地 获得重组 thaumatin ,人们对丝状真菌表达系统进行了各种优化 ,如选用特异性强启动子 、增加基因 拷贝数 、利用蛋白酶缺陷株 、进行基因融合 、优化反应条件等 。随着丝状真菌表达系统的优化 ,重 组 thaumatin 的产量也随之提高 。 [ 关键词 ] 丝状真菌 ;表达系统 ;启动子 ;优化 [ 中图分类号 ] Q 503 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 100520310 (2003) 0320075203
[ 收稿日期 ] 2003 - 04 - 10 [作者简介 ] 裴凌鹏 (1976 —) ,男 ,北京市人 ,北京联合大学应用文理学院助教 ,理学硕士 ,从事食品生物技术 、基因工 程 、分子细胞生物学教学与研究 。
Fra Baidu bibliotek
76
北京联合大学学报 (自然科学版)
2003 年 9 月
awamori) 谷氨酸脱氢酶基因 (glutamate dehydrogenase gene ,gdhA) 的启动子 ,产黄青霉 ( penicillium chrysoge2 num) 异青霉素 N - 合酶基因 (isopenicillin N2synthase gene) 的启动子 , Acremonium chrysogenum B2 宽光谱 脂酶基因 (B2 wide2spectrum esterase gene ,cesB) 的启 动子等 。1999 年 ,Moralejo F. J 等人[4] 利用 gdhA 启 动子 、gpdA 启动子构建不同的 thaumatin 基因表达 盒 ( express cassette ) , 转 入 丝 状 真 菌 Aspergillus awamori 中 ,得到的 thaumatin 不仅有甜味 ,而且表达 产量也比在其他微生物中的高 。
1 启动子
用强的启动子能增加外源基因在丝状真菌中 的表达产量 ,而这些强的启动子均来自高效表达的 丝状真菌基因 。如构巢曲霉 ( Aspergillus nidulas) 甘 油醛 - 3 - 磷 酸 脱 氢 酶 ( glyceraldehyde232phosphate dehydrogenase, gpdA) 的 启 动 子 , 泡 盛 酒 曲 酶 ( A .
4 基因融合
为了防止重组 thaumatin 被降解 ,提高 thaumatin 的分泌效率 ,在丝状真菌表达系统中往往采用基因 融合的方式 ,即把一个在丝状真菌中能高效表达的 基因截短 ,与 thaumatin 基因融合 ,构建成载体 ,在丝 状真菌中进行表达 。Faus I[3] 和 Moralejo F. J [4] 分别 在丝状真菌中对 thaumatin 进行融合表达 ,得到的产 量比较高 。