转基因动物技术课件
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• Knock-out label
FLP/frt重组系统
• 来自啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
• 其中重组酶FLP可催化位于同一分子上
两个同向frt位点间DNA片段的同源重
组，实现基因切除的效果。
• 作为“第二分子开关” FLP/frt系统与 Cre/loxP系统一起，更精密的调控基因
表达
时间控制和组织特异性表达
• Cre的表达还可以通过在启动子上引入相 应某种配体的元件(比如某种药物)而达 到时间控制和组织特异性表达。
• 四环素、1型干扰素、三苯氧胺 (Tamoxifen，可以与一种与雌激素受体 相互作用的蛋白相结合)都被用于获得药 物诱导型的启动子。
Si-Bmi-1
LSL-Cre : loxp-stop-loxp, Cre FSF-Flpo: FRT-stop-FRT, Flpo Established Lung Tumors
• Neo基因
卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷 酸转移酶II，基因记做neo，能通过降 解G418、新霉素和卡那霉素来实现真核 和原核细胞的相应抗性。
一般应用于原核生物就是卡那霉素抗 性基因,应用于真核生物就是G418抗性。
外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法
二、ES细胞打靶和筛选
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶，自杀基因
• HSV－tk基因的产物使细胞能利用培养基中的 GANC (Gancyclovir，丙氧鸟苷）而死亡
• 例如将在肝癌细胞中可表达AF基因的调控区 与水痘一带状疮疹病毒中的胸苷激酶（VZVTK）基因进行重组，构建逆转录病毒载体导 入体内，TK基因只在肝癌细胞中表达，产生 的TK可催化6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷磷酸化产 生araAMP，进一步磷酸化形成细胞毒物质 araATP，杀死肝癌细胞。
STRATAGENE， Agilent Technologies Inc
分子开关--Cre/Loxp 系统
Cre：由P1噬菌体编码的约38KD的重组酶，不仅具 有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列。
可以特异性的识别并催化34个碱基重复序列的loxP
之间的DNA同源重组。
Loxp位点：[ locus of crossing-over (x) in P1 ] site:
Mario Capecchi and Oliver Smithies, independently of each other, discovered how homologous recombination between segments of DNA molecules can be used to target genes in the mammalian genome and developed methods to generate genetically modified mice.
Transgenic Technology
Definition
Transgenic technology refers to the genetic engineering of an
organism so that its genomic DNA
is altered to over- or underexpress certain genes.
Oliver Smithies Martin J. Evans Mario R. Capecchi
Evans’s work: The ES cells
embryonic stem cell，ES • Stem cell
somatic stem cell
• Martin talks about his work
• Transgenic technique • Gene Knock Out • Gene Knock In • Gene Knock Down • Gene Trapping
• mouse, rabbit, rat, sheep, pig, caw etc.
• The 2019 Nobel Prize in physiology or medicine is awarded for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells.
三、囊胚注射和杂交筛选
小鼠基因型的鉴定？
• 标准品系： ES细胞品系：E14Tg2a (129背景)；
JM8(C57BL/6N品系)； JM8A3(C57BL/6N 品系， Agouti毛色)
注射用囊胚品系：C57BL/6×C57BL/6
• 129和C57BL/6纯系小鼠 近交系Inbred Mice
位；
•
3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA
链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染
色体易位。
两个loxp位点的方向相反
promoter loxp
Gene
promoter loxp
Cre Gene
loxp loxp
• Knock-out gene • Knock-out stop cassette
转基因小鼠构建过程
• 构建打靶载体 • ES细胞打靶和筛选 • 囊胚注射 • 动物杂交筛选
北京诺兰信科技 北京高校生物技术转化平台
25 Health Sciences Drive Stony Brook, NY 11790-3350，USA genetargeting/
一、打靶载体
定点突变技术
Cre-LoxP系统的特性
源自文库
• Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、 可逆的过程，可以分成三种情况：
•
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方
向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序
列；
•
2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方
向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒
FLP/frt重组系统
• 来自啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
• 其中重组酶FLP可催化位于同一分子上
两个同向frt位点间DNA片段的同源重
组，实现基因切除的效果。
• 作为“第二分子开关” FLP/frt系统与 Cre/loxP系统一起，更精密的调控基因
表达
时间控制和组织特异性表达
• Cre的表达还可以通过在启动子上引入相 应某种配体的元件(比如某种药物)而达 到时间控制和组织特异性表达。
• 四环素、1型干扰素、三苯氧胺 (Tamoxifen，可以与一种与雌激素受体 相互作用的蛋白相结合)都被用于获得药 物诱导型的启动子。
Si-Bmi-1
LSL-Cre : loxp-stop-loxp, Cre FSF-Flpo: FRT-stop-FRT, Flpo Established Lung Tumors
• Neo基因
卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷 酸转移酶II，基因记做neo，能通过降 解G418、新霉素和卡那霉素来实现真核 和原核细胞的相应抗性。
一般应用于原核生物就是卡那霉素抗 性基因,应用于真核生物就是G418抗性。
外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法
二、ES细胞打靶和筛选
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶，自杀基因
• HSV－tk基因的产物使细胞能利用培养基中的 GANC (Gancyclovir，丙氧鸟苷）而死亡
• 例如将在肝癌细胞中可表达AF基因的调控区 与水痘一带状疮疹病毒中的胸苷激酶（VZVTK）基因进行重组，构建逆转录病毒载体导 入体内，TK基因只在肝癌细胞中表达，产生 的TK可催化6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷磷酸化产 生araAMP，进一步磷酸化形成细胞毒物质 araATP，杀死肝癌细胞。
STRATAGENE， Agilent Technologies Inc
分子开关--Cre/Loxp 系统
Cre：由P1噬菌体编码的约38KD的重组酶，不仅具 有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列。
可以特异性的识别并催化34个碱基重复序列的loxP
之间的DNA同源重组。
Loxp位点：[ locus of crossing-over (x) in P1 ] site:
Mario Capecchi and Oliver Smithies, independently of each other, discovered how homologous recombination between segments of DNA molecules can be used to target genes in the mammalian genome and developed methods to generate genetically modified mice.
Transgenic Technology
Definition
Transgenic technology refers to the genetic engineering of an
organism so that its genomic DNA
is altered to over- or underexpress certain genes.
Oliver Smithies Martin J. Evans Mario R. Capecchi
Evans’s work: The ES cells
embryonic stem cell，ES • Stem cell
somatic stem cell
• Martin talks about his work
• Transgenic technique • Gene Knock Out • Gene Knock In • Gene Knock Down • Gene Trapping
• mouse, rabbit, rat, sheep, pig, caw etc.
• The 2019 Nobel Prize in physiology or medicine is awarded for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells.
三、囊胚注射和杂交筛选
小鼠基因型的鉴定？
• 标准品系： ES细胞品系：E14Tg2a (129背景)；
JM8(C57BL/6N品系)； JM8A3(C57BL/6N 品系， Agouti毛色)
注射用囊胚品系：C57BL/6×C57BL/6
• 129和C57BL/6纯系小鼠 近交系Inbred Mice
位；
•
3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA
链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染
色体易位。
两个loxp位点的方向相反
promoter loxp
Gene
promoter loxp
Cre Gene
loxp loxp
• Knock-out gene • Knock-out stop cassette
转基因小鼠构建过程
• 构建打靶载体 • ES细胞打靶和筛选 • 囊胚注射 • 动物杂交筛选
北京诺兰信科技 北京高校生物技术转化平台
25 Health Sciences Drive Stony Brook, NY 11790-3350，USA genetargeting/
一、打靶载体
定点突变技术
Cre-LoxP系统的特性
源自文库
• Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、 可逆的过程，可以分成三种情况：
•
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方
向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序
列；
•
2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方
向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒