分子遗传学PPT

2 材料和方法
2.1 植物材料
1）染色体交换片段置换系RCSSLs（携带有S24基因
片段)
the japonica variety Asominori ×the indica variety IR24 (Kuboet al.2002)
染色体交换片段 置换系RCSSLs
2）近等位基因系NILs
在近等位基因系中，除了S24基因位点不同，染色 体他的位点都是相同的。
花粉可育率＞90％，为可育； 花粉可育率70％- 90％，为部 分不育； 花粉可育率30％- 70％，为半 不育；
2.3 DNA分析和连锁图谱的构建
1）DNA样品的准备； 2）引物的设计：根据日本晴和93-11的DNA序列设计得
到SSR标记引物； 3）PCR反应：变性，94 ℃,20 S；退火，56 ℃,20 S；延
由于日本晴和93-11的基因组已经被完全测序，因此我 们决定用这两个品种进行进一步的分析。首先，我们需要 确定同样的S24位点存在日本晴和93-11中，然后鉴定上位 基因隐藏在粳稻遗传背景中。
1）作为亲本的日本晴和93-11均有＞90％的花粉可育性；
他们的互补杂交的F1 代 （日本晴/93-11 和93-11/日 本晴）分别表现了～37.8 % 和 ～ 42.9 %的花粉可育性；
一步研究。
另外，在一个水稻杂交组合中，由于上位三个不连锁的 位点导致的雌性不育被发现。一个孢子体和两个配子体基 因相互作用导致了携带一对特殊等位基因的雌配子选择性 败育(Kubo and Yoshimura 2005)。他们进一步提出：杂交 不育是由多种上位因子组成的复杂网络来控制的。
我们用了均匀分布在12条染色体上的76个PCR标记对BC2F1群体进 行了QTL分析，检测到了两个可能的与花粉不育有关的QTL位点，即2号 染色体上的qPS2位点和5号染色体上的qPS5位点(Table 2)。
qPS5 QTL与标记chr05-109和mS3连锁，在杂合基因型的植株中降
低花粉的可育性。由于其位点和表型效应与S24相同，所以它被认为就 是S24位点。
可以把EFS基因定位在2号染色体上mE3与mE5之间的 817kb大小的片段上(Figure 3D) 。
3.3 EFS位点的遗传解析
3.4在孢子体中,选择性传递的S24-j配子 的不育性被EFS-i抵消
双杂合体(NILS24+EFS)与日本晴互补杂交 如果EFS在配子体中发挥作用，S24-j/efs-j基因型的花 粉将被选择性淘汰；相反，如果在孢子体中发挥作用， 则其基因型比例率符合理论比1:1:1:1（Table 3）。
QTL分析
Selfing BC2F1 × Nipponbare
多样性和表型分析
BC2F2 Selfing BC3F1 × Nipponbare
BC3F2
BC4F1
2.2 表型鉴定
1）花粉的采集；花粉的固定染色； 花粉的镜检统计； 2)每个植株统计超过300个花粉粒； 3）呈深红色的正常大小的饱满花 粉粒为可育表型；呈浅红色或无色 空瘪、畸形的花粉粒为不育表型。 4）在本研究中，
2）对BC4F1 群体在花粉育性表型上的分析也证明了EFS的影
响作用(Figure 3, B and C)。 3）在BC2F2 ，BC3F2 和BC4F1群体中，基因型S24-i/S24-j efs-
j/esf-j表现了两种表型：半不育（30.3-59.1％）和部分不育 （74.0-82.3％） ( Figure S2)。
AI-NIL- F2 表现为严重的分离变相，jp/jp基因型比例为4.2％，表明在 后代中优先传递籼稻S24-i等位基因(Table 1)。
籼稻遗传背景下的金等位基因系：
IA-NIL- F1表现为92.9％的花粉可育性(Figure 1)。 IA-NIL- F2中，基因型比例jp/jp:in/jp:in/in=23:21:25 ，jp/jp基因型
败育。
1.2 本研究作者分析了这种雄性不育是否仅仅由S24 单个 座位引起的。结果发现S24 受到上位性的调控。
1.3 对BC2F1 群体进行QTL 分析，发现了一个位于水稻第2
染色体与S24 互作的、新的不育位点，该位点被命名为EFS （S24 互作因子，Epistatic Factor for S24）。
标记位点mS3和mE4之间，即qPS5（S24)和 qPS2之间 (Figure2B, Table S2 )。 mS3（S24)的杂合位点与日本晴 的纯合的mE4（qPS2）位点组合大量的降低了花粉的可育性
（63.7％），而其他基因型组合的花粉可育性＞95.0％。
这样的结果表示， qPS2 可能与mS3（S24)联合作用
3.3 EFS位点的遗传解析
3.3 EFS位点的遗传解析
3.3 EFS位点的遗传解析
4）检测BC2F2, ， BC3F2 和BC4F1 群体中S24杂合基因
型的共140株植株，我们发现了在EFS和标记位点
之间发生重组的两株植株：
BC4F1-8-4-39 在mE3和mE4之间发生重组。 BC3F2 -8-4-37 在mE4和mE5之间发生重组。 这两个重组体均表现花粉可育表型，因此我们可以确 定EFS-i存在两个重组体的染色体重叠区域。于是，我们便
"花粉杀手"位点的上位性遗传互作引 起水稻的雄性不育
Contents
1 Abstract 2 Materials and Methods 3 Results 4 Discussion
1 摘要
1.1 在栽培稻(Oryza sativa)亚种籼稻和粳稻的种间杂交 的杂种中，杂种雄性不育基因S24 通过等位基因间的相互 作用，选择性地致使携带有粳稻等位基因S24-j 的雄胚子
双杂合体(NILS24+EFS)与日本晴互补杂交
因此，由上面的实验分析可以得到以下结论： ①EFS基因是在孢子体中发挥作用的； ②在EFS-i/efs-j杂合体中，S24-j雄配子能正常发育且
能将其基因传递给后代； ③在S24杂合子中，EFS-i可以抵消S24-j在花粉中的
不育性；
4 讨论
1）多个上位互作因子影响S24基因
1 摘要
1.4 进一步的遗传分析表明当S24与粳稻的EFS 等 位基因efs-j组合在一起的时候引起雄性不育。结 果表明efs-j是一个孢子体隐性等位基因，籼稻显 性等位基因EFS-i可以抵消S24引起的花粉不育。
1.5 本研究证明了一个新的遗传上位互作座位，是 单座位等位基因互作引起的杂种雄性不育的一个 重要的作用元件。这个发现为加深我们对杂种不 育和小孢子形成的复杂分子机理的理解具有重要 贡献。
我们在BC1F1回交后代的8个植株中鉴定到了一个可育 的分离体（表现为90.8％的花粉可育性），他携带了包含 有S24位点的杂合片段。
3.2 花粉不育的上位因子解析
2）检测影响花粉不育的其他遗传因子
用BC1F1群体的可育植株与日本晴回交得到分离的BC2F1群体，它们 显示了花粉可育性的广泛分布（37.3-100％的花粉可育），即存在两 种不育表型：半不育和部分不育(Figure 2A)。
qPS2 QTL与标记mE4连锁，在杂合的植株中增强花粉的可育性。
3.2 花粉不育的上位因子解析
3）全基因组的相互作用分析鉴定影响花粉可育的重要 的上位性标记对,结果我们得到了两对标记：
qPS5（S24)/ qPS2 和 Chr4-3173/chr9-0755
双向方差分析表示，一个重要的相互作用因子存在于
双杂合体(NILS24+EFS)与日本晴互补杂交
在两个不同的后代群体中，双杂合体(NILS24+EFS)产生S24j/S24-j基因型后代的比例为17.8％（ BC3F2-8-4）和21.7 ％（ BC4F2-8-4-1）。这样的比例明显高于BC3F2-8-6群体 的遗传频率5.7％。
注： BC3F2-8-6是BC3F2-8-4的一个姐妹株系，基因型为S24-i/S24-j efs-j/efs-j。
上面讲到的花粉不育主要是因为在S24位点的等位 基因的相互作用。如果等位基因间的相互作用足以引 起花粉不育的表型，那么同样的表型应该可以在任何 遗传背景下都可以被看到？
3.1 S24基因的不育性依靠其遗传背景
为此，我们培育了S24的两个近等位基因系，结果如下：
粳稻遗传背景下的近等位基因系：
AI-NIL- F1 表现为花粉半不育（41.8﹪的花粉可育） (Figure 1)。
比例为33.3％，即使他们的分离比也偏离了1:2:1。
这些结果证明了，在籼稻遗传背景中，S24杂合体的 S24-j雄配子是可育的，且能正常传递给后代。因此，我们 能说，S24杂合基因仅仅在粳稻遗传背景下才能导致雄性不 育，这样的花粉不育的遗传机理必然涉及到了基因的上位 作用。
3.2 花粉不育的上位因子解析
伸，72 ℃,30-60 S；共30个循环。 4）PCR产物的电泳和数据统计； 5）连锁图谱的构建：应用Map Manager QTX version
0.30软件进行连锁图谱的构建。
2.4 QTL分析和EFS位点解析
1）QTL和上位互作分析 在Map Manager QTX version 0.30软件中进行标记回 归分析，检测到了QTL之间的上位互作效应。双向方 差分析（ a two-way ANOVA）计算得到他们的互作效 应以及重要性。
Asominori（ ♀） × RCSSLs（ ♂）
AI-NIL- F1
（具有粳稻遗传背景的近等位基因系）
IR24 （ ♀） × RCSSLs（ ♂ ）
IA-NIL- F1
（具有籼稻遗传背景的近等位基因系）
3）日本晴和93-11的杂交后代
Nipponbare × 93-11 F1 × Nipponbare BC1F1 × Nipponbare
2）EFS位点的定位将用到BC2F2，BC3F2和BC4F1群体。在
140株S24杂合子植株中，通过标记辅助选择确定了mS1 和mS2被用来定位EFS。
3 结果
3.1 S24基因的不育性依靠其遗传背景
S24基因在2008年由Kubo et al.在粳稻栽培稻中的一 个籼稻染色体片段中发现。S24位点引起的花粉不育归 因于在杂合子中携带S24-j（japonica allele for S24)基 因的雄配子选择性败育，导致了在S24位点的严重分离 变相有利于分离后代群体中得籼稻等位基因（Kubo et al. 2008）。
一般情况，“花粉杀 手”导致花粉不育仅仅是
在S24位点杂合时。因此
过去认为，等位基因间的 互作是引起雄性杂交不育 的关键。
我们来自百度文库究表明，仅仅
当efs-j位点纯合时，S24
等位基因间的相互作用才 变得活跃；
S24- EFS间的相互作
用可解释为：孢子体和配 子体之间通过两个独立位 点来相互作用（Figure
4A）。
1）多个上位互作因子影响S24基因
另外一个互作因子，S35，已经被证明在S24杂合子中与 S24作用增强花粉的不育性（Kubo et al. 2008)。
S35基因需要S24-i等位基因的存在才能引起花粉不育， 但S24能独立于S35诱导半不育的发生。因此他们之间的作 用是单向的（Figure 4B）。S35与EFS之间的关系还有待进
3.3 EFS位点的遗传解析
1） 在BC2F2 和BC3F2 群体中，根据EFS连锁的mE4标记和S24 连锁的mS2/mS3标记，我们共评估了9个基因型种类。
3.3 EFS位点的遗传解析
由上面的表格可以发现，杂合基因型S24-i/S24-j仅只有 当与纯合的efs-j/esf-j组合时，才能表现出花粉不育。而其 他的基因型组合没有表现异常的花粉表型，这久充分的证 明了EFS的存在；也充分证明了当隐性esf-j等位基因纯合时， 它在S24杂合体中导致了雄性不育。
于花粉的可育性。由于2号染色体的这个区段并未见报道过
相关的花粉不育基因，故将qPS2这个新位点命名为EFS
(Epistatic Factor for S24)。
3.2 花粉不育的上位因子解析
另外一对相互作用位点Chr4-3173/chr9-0755，也严
重的降低了花粉的可育性（65.5％）( Table S2 ) 。然而， 进一步分析，他们之间的位点并没有显示任何相互作用影 响花粉的不育性（数据没有显示）。