支原体的培养方法

支原体培养检验操作程序

一、接收标本：标本与检验单查对正确，标本质量合格。

二、标本处理：接种Uu、Mh培养药敏一体试剂盒：操作前将所需试剂取出置室温30分钟。1、A排第一孔加入培养液100μL作为阴性对照；2、将标本拭子直接放入培养液中充分振荡并在瓶壁挤干拭子，若为男性尿液取离心沉淀物150μL或阳性标本取50μL于培养液中混匀。3、将混有标本的培养液各100μL加入A排余下及B排各孔中；4、各孔加矿物油覆盖，置于37℃温箱培养。

第24、48小时分别观察记录结果。结果判断原理：培养基含有相应支原体生长所需的蛋白质、马血清、生长因子、底物及酚红指示剂，当有支原体生长时，底物被分解，使PH值升高，培养基由橙黄色变成红色，且清亮为阳性。培养基不变色为阴性。B1孔阳性为解脲支原体阳性；B2孔阳性为人型支原体阳性。药敏孔A排为高浓度，B排为低浓度，变红则耐药，不变红示敏感而不生长。当高浓度与低浓度两孔均不生长(不变色)为该药敏感；高浓度不变色低浓度变红为该药物中介；高浓度与低浓度均变红为该药物耐药。

结果一：第24 小时B1孔由橙黄色变成红色示解脲支原体阳性，药敏看结果判断；第24小时、48小时观察B2孔均不变色，示无人型支原体生长或浓度极低，报告培养出解脲支原体，未培养出人型支原体。

结果二：第24 小时B1孔不变色示解脲支原体阴性；第48小时观察B2孔由橙黄色变成红色示人型支原体阳性，药敏看结果判断。报告未培养出解脲支原体，培养出人型支原体附药敏结果。

结果三：第24 小时B1孔由橙黄色变成红色示解脲支原体阳性，药敏看结果判断；第48小时观察B2孔由橙黄色变成红色示人型支原体阳性，药敏看结果判断，报告培养出解脲支原体与人型支原体附药敏结果。

结果四：阳性对照孔由橙黄色变成红色示支原体阳性，药敏看结果判断；第24小时、48小时观察B1孔、B2孔均不变色，示无解脲、人型支原体生长或浓度极低，报告培养出非解脲、人型支原体或嘱病人重留标本复查。

结果五：第24、48小时观察B1孔、B2孔均不变色，示无支原体生长或浓度极低，报告未培养出解脲及人型支原体。

支原体的培养技巧

一般培养比较多的是肺炎支原体（MP），解脲脲原体(UU）是耐酸不耐碱的，UU培养的原理是在于其菌体中含有脲酶，而UU培养基中含有尿素，UU的生长需要其本身的脲酶分解尿素益提供其自身生长所需要的营养物质，UU培养基中含有指示剂酚红，由于尿素被分解释放出氨从而使培养基变碱而使培养基由黄变红，但是这种红是一种清亮的红色，透明澄清无浑浊，UU其适宜的PH值为6.2-6.5，由于尿素分解产氨是PH上升，UU在PH值大于7的条件下会迅速死亡，因此，在培养时要随时观察其液体培养基的PH 值，一旦看到培养基变红，要立即取出，以防培养基PH上升导致UU死亡，一般UU需要在培养至对数生长期时是活力最强的时候（培养基呈橙红色变化）。一般UU生长需要24小时。

UU的计数也和普通细菌不同，采用颜色单位改变法（CCU法），因为UU的生长是澄清清亮透明的，因此无法用一般的比浊法来计数！

UU的保存：在UU生长到对数生长期时，采用甘油保存法，甘油和菌液的比例为3：7，（甘油高压灭菌），采用程序降温法，献4度1小时，在－20度2小时，最后放到－80度，但是在－80度最长不要超过半年，因此需要每隔2－3个月将菌株复苏一次到对数生长期后再保存！

另外，UU生长所需要的培养基的成分一般每隔单位有所不同，但是有一点肯定，就是需要小牛血清。

器具泡酸的目的是为了去除杂质，一般在做细胞培养是需要泡酸，做细菌方面的工作要求不需要如此严格的，只需要洗干净，高压消毒就可以了，在配培养基时用的是三蒸水，把培养基配好后，最后再加入血清，然后调到所需的PH值，不可以高压，只能用0.22um的滤膜过滤除菌！培养基配好后，4度放半年没问题！没有从动物身上分离UU，但是刚一开始做时，是从病人的临床分泌物中分离，临床分离株需要纯化，因为临床株常常含有很多杂质，这些杂质会影响UU的生长，导致UU的CCU常常达不到10的3次方，因此对临床株需要纯化，可以在固体平板上见到油煎蛋样菌落，用灭菌小刀切取菌落琼脂块，移入液体培养基中压碎进行培养，等到培养基变黄后，用液体培养基稀释培养物到10的-4或-5次方，再取0.2-0.4ml于固体平板上，这样反复2-3次，就可以得到支原体的纯种。

CCU一方面和细菌本身浓度有关，另一方面，确实与培养基成分有很大关系，如果培养基营养成分差，很难作出来，如果培养基中只含有盐成分的话，高压是没问题的，如LB培养基，但是如果里面含有小牛血清或糖类等物质的话，绝对不可以高压，因为这样会破坏营养成分，只可以过滤除菌！

解脲脲原体培养基配制：（在自制培养基基础上加：）PH：6。13

小牛血清：30ml/250ml

10％尿素：12 ml/250ml

0．2％酚红：4。5 ml/250ml

青霉素G：50万U/250ml

酵母：6。25 g/250ml

磷酸二氢钾：0。375 g/250ml

天门冬素：0。025 g/250ml

自制培养基包括：新鲜牛肉浸液：90毫升

蛋白胨：1克

氯化钠：0。5克

磷酸二氢钾：0。15克

（此自制培养基可以高压灭菌）。

加琼脂配成固体，一般1％即可！

支原体是能够在无生命培养基上生长的最小微生物，其生长特点是在液基中是清亮的，因此他的计数无法通过比浊法，其对数生长期在液体中的表现是表现为橙红色，这是支原体的代谢活力旺盛，如果颜色呈现桃红色或深红色，这时UU的活力就会下降，因为UU的最合适PH为6.0-6.5,这时培养基的PH偏碱，UU 可能已死亡。为了区分颜色，可以用一管液体培养基作为颜色改变对照，黄色和橙红色还是比较好区分的！

Uu的最适生长PH在6.0－6.1之间，这可能与培养基的配制有关。关于Uu的计数，CCu是最好的方法：200ul菌液加入第一瓶1.8ml液态培养基中混匀，然后从中取出200ul加入第二瓶1.8ml液体培养基中，混匀，以此类推，10倍稀释11瓶，做3组平行试验，求平均值即可。注意，每步操作都要换枪头。

对于Uu的保存，其实方法也很简单：

1、用液体培养基培养15－17h（溶液有桔黄色变为橙红色，而且基本在对数生长期左右），直接放入0度或－20度，2个月是没问题的，如果不放心的话，可隔一个月检查一下活性。

2、如果条件允许的话，可将培养至对数生长期的阳性液先预冻，然后抽真空即可。保存几年是没问题的。复苏的时候，直接向其中加入Uu培养基培养即可。