放射免疫测定法
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1968年 放射受体分析法(RRA)
1971年 Addison和Hales建立双位点或夹心IRMA
二、RIA原理
基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的 待检抗原（Ag）同时与限量的特异性抗体进行竞争结 合或竞争性抑制反应，通过测定结合（ *Ag-Ab ）的或 游离（ *Ag ）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线 即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。
双抗体法
固相法
入第二抗体，形成第二抗体复合物，离心
抗体或抗原固相化，免疫反应在固相载体上完成后洗涤
SPA法
金黄色葡萄球菌A蛋白促使AgAb较快速度沉淀
三、RIA法标准曲线
标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。
这种曲线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的 特定函数关系，也称为剂量反应曲线。
RAI属超微量分析技术，常用于胰岛素、生长激素、药 物等微量物质的测定。
Ag
*Ag
Ab
Bound B
Free F
0.67 0.33
B/F
2
0.50
0.50
1
0.33
0.67
0.5
0.17
0.83
0.2
竞争放射分析原理示意图
常用标记放射性同位素及其性质
放射性元素 半衰期 射线种类及能量（百万电子伏特）
/ %
50 30 10 0 1 10 100 1000
未标记抗原浓度（ng/ml)
RIA竞争抑制曲线类型
注：横坐标为标记抗原（*Ag）的浓度
四、建立放射免疫分析方法的必备条件
对标准抗原的基本要求
(1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致。
(2)抗原必须纯度高。 (3)标准抗原的量必须准确。
(4)标准抗原应有很好的稳定性。
放射性核素标记物制备的主要方法
氯胺T法 活化NaI中放射性碘离子
乳过氧化酶法
催化过氧气化氢释放新生态氧，使125I离子活化
双酶标记法
葡萄糖氧化酶提供过氧化氢作为乳过氧化酶底物
氯甘脲标记法
活化NaI中放射性碘离子
放射性同位素标记化合物的纯化方法
凝胶过滤法
离子交换法 透析法 电泳法 亲和层析法 高效液相层析法 ConA吸附法
分离标记蛋白与无机碘
用于分离纯化短肽标记物 将标记蛋白与小分子化合物很好地分离 分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质 利用特异抗体或受体结合分离、纯化标记蛋白质 分离效果好、快速 分离标记糖蛋白
二、RIA操作程序
配制已知浓度系列标准抗原（Ag）
加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育
加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育
分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F）
用γ计数器测量放射性计数
根据标准曲线或计算机直接算出
1.样品或标准品 2.标记物 3.抗血清 分离剂
混匀
混匀
立即
温浴
1.加样 2.加分离剂
3.离心
4.去上清分离 5.测量
动态平衡体系中:
*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力
*Ag和Ab的量恒定
亲和力:抗体结合的强度是RIA的前提
特异性:不受交叉反应物质影响的程度
滴度:抗体的效价——抗体实际应用时的稀释倍数
B/F
1
斜率＝－KA
0
3
Ag-Ab浓度
亲和力测定（Scatchard作图）
C
复 合 物 放 射 性
100
A
50
B
0 1 2 3 4 5 6
Log竞争剂浓度
特异性的测定－－交叉反应检测
放射免疫测定（RAI）：根据抗原抗体特异性结合的 原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的 多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。
RIA方法学研究进展
1959年 Yalow和Berson建立放射免疫测定（RIA） 1960年 竞争性蛋白结合分析（CPBA）
1968年 Miles和Hales建立免疫放射量度分析（IRMA）
标准曲线的手工绘制形态
标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同 ，或所采用坐 标系统不同而有不同的形态。
标准曲线的基本数学函数式
放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是 双向性的，服从质量作用定律。
结 合 未 结 合 的 放 射 活 性 （ ）
75
待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系
β
14C
γ
－ － 0．035 0.364，0.637，0.722
5720年 12.5年 60天 8.05天
0.155 0.0189 － 0.608，0.335，0.250
3H
125I
131I
125I的优点 29种同位素，125I最为常用；
半衰期适中(60天)，易于商品化和储存，也利于废物处理； 发射低能35kV γ线易于测量，井型闪烁效率高； 不发射β粒子，标记物自分解速度低； 标记过程中，标记物免疫损伤小； 化学性质活泼，标记Ag和Ab容易，可得到多种标记物而 广泛应用。
Ag+*Ag的分子数大于抗体的分子数 *Ag与Ag相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag 与*AgAb呈负相关函数关系测抗原（Ag）和抗体 （Ab）--温育
结合抗原(B)与游离抗原(F)分离方法
沉淀法
吸附法 过滤法
加涂有右旋糖酐的活性碳（DCC）吸附小分子F，离心
调pH值于γ 球蛋白等电点，加入适当浓度PEG或中性盐 小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤膜而分离
对抗血清的要求 抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。检查抗血清质量的指标主要
有亲和常数(K)、免疫交叉反应率及滴度(或抗体效价)。
对标记抗原的要求 (1)标记抗原的免疫活性与待测抗原及标准品必须一致。
(2)标记抗原要有适当高的放射性比活度。
(3)标记抗原应具有足够高的放射化学纯度
衡量抗体质量的指标
交叉反应率 ＝A50/B50×100％
B%
100 80
60
40 20
0 100 1000 10000 100000
抗血清稀释度
抗体滴度测定
五、放射免疫分析的设计方法
◆ 标讥抗原和抗体用量最佳化设计: 1、标记抗原用量选择。 2、抗血清的使用滴度选择及其方法。 ◆ 标准抗原剂量设计 1、标准抗原剂量范围 2、标准曲线工作范围 ◆ 加样顺序设计 ◆ 反应介质 ◆ 反应容积与温度及时间 1、缩小反应容积可相应减少抗体和标记抗原的绝对用量，使 非标记抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵敏度。 2 、抗原、抗体结合反应的平衡结合常数 K 与温度有关，必须 通过实验来确定最佳工作条件。 ◆ 与F分离方法选择 ◆ 样品采集与保存
第五节、放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA)
一、基本概念
同位素（isotope）：元素周期表中处于相同位置的某 种元素所包含的若干种核素。 放射性核素（radionuclide）：由于核内中子数和质子 数的比例不适而自发地发生核衰变，在衰变过程中将放 射出一种或几种射线而转变为别种核素的不稳定核素。
1971年 Addison和Hales建立双位点或夹心IRMA
二、RIA原理
基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的 待检抗原（Ag）同时与限量的特异性抗体进行竞争结 合或竞争性抑制反应，通过测定结合（ *Ag-Ab ）的或 游离（ *Ag ）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线 即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。
双抗体法
固相法
入第二抗体，形成第二抗体复合物，离心
抗体或抗原固相化，免疫反应在固相载体上完成后洗涤
SPA法
金黄色葡萄球菌A蛋白促使AgAb较快速度沉淀
三、RIA法标准曲线
标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。
这种曲线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的 特定函数关系，也称为剂量反应曲线。
RAI属超微量分析技术，常用于胰岛素、生长激素、药 物等微量物质的测定。
Ag
*Ag
Ab
Bound B
Free F
0.67 0.33
B/F
2
0.50
0.50
1
0.33
0.67
0.5
0.17
0.83
0.2
竞争放射分析原理示意图
常用标记放射性同位素及其性质
放射性元素 半衰期 射线种类及能量（百万电子伏特）
/ %
50 30 10 0 1 10 100 1000
未标记抗原浓度（ng/ml)
RIA竞争抑制曲线类型
注：横坐标为标记抗原（*Ag）的浓度
四、建立放射免疫分析方法的必备条件
对标准抗原的基本要求
(1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致。
(2)抗原必须纯度高。 (3)标准抗原的量必须准确。
(4)标准抗原应有很好的稳定性。
放射性核素标记物制备的主要方法
氯胺T法 活化NaI中放射性碘离子
乳过氧化酶法
催化过氧气化氢释放新生态氧，使125I离子活化
双酶标记法
葡萄糖氧化酶提供过氧化氢作为乳过氧化酶底物
氯甘脲标记法
活化NaI中放射性碘离子
放射性同位素标记化合物的纯化方法
凝胶过滤法
离子交换法 透析法 电泳法 亲和层析法 高效液相层析法 ConA吸附法
分离标记蛋白与无机碘
用于分离纯化短肽标记物 将标记蛋白与小分子化合物很好地分离 分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质 利用特异抗体或受体结合分离、纯化标记蛋白质 分离效果好、快速 分离标记糖蛋白
二、RIA操作程序
配制已知浓度系列标准抗原（Ag）
加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育
加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育
分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F）
用γ计数器测量放射性计数
根据标准曲线或计算机直接算出
1.样品或标准品 2.标记物 3.抗血清 分离剂
混匀
混匀
立即
温浴
1.加样 2.加分离剂
3.离心
4.去上清分离 5.测量
动态平衡体系中:
*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力
*Ag和Ab的量恒定
亲和力:抗体结合的强度是RIA的前提
特异性:不受交叉反应物质影响的程度
滴度:抗体的效价——抗体实际应用时的稀释倍数
B/F
1
斜率＝－KA
0
3
Ag-Ab浓度
亲和力测定（Scatchard作图）
C
复 合 物 放 射 性
100
A
50
B
0 1 2 3 4 5 6
Log竞争剂浓度
特异性的测定－－交叉反应检测
放射免疫测定（RAI）：根据抗原抗体特异性结合的 原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的 多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。
RIA方法学研究进展
1959年 Yalow和Berson建立放射免疫测定（RIA） 1960年 竞争性蛋白结合分析（CPBA）
1968年 Miles和Hales建立免疫放射量度分析（IRMA）
标准曲线的手工绘制形态
标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同 ，或所采用坐 标系统不同而有不同的形态。
标准曲线的基本数学函数式
放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是 双向性的，服从质量作用定律。
结 合 未 结 合 的 放 射 活 性 （ ）
75
待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系
β
14C
γ
－ － 0．035 0.364，0.637，0.722
5720年 12.5年 60天 8.05天
0.155 0.0189 － 0.608，0.335，0.250
3H
125I
131I
125I的优点 29种同位素，125I最为常用；
半衰期适中(60天)，易于商品化和储存，也利于废物处理； 发射低能35kV γ线易于测量，井型闪烁效率高； 不发射β粒子，标记物自分解速度低； 标记过程中，标记物免疫损伤小； 化学性质活泼，标记Ag和Ab容易，可得到多种标记物而 广泛应用。
Ag+*Ag的分子数大于抗体的分子数 *Ag与Ag相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag 与*AgAb呈负相关函数关系测抗原（Ag）和抗体 （Ab）--温育
结合抗原(B)与游离抗原(F)分离方法
沉淀法
吸附法 过滤法
加涂有右旋糖酐的活性碳（DCC）吸附小分子F，离心
调pH值于γ 球蛋白等电点，加入适当浓度PEG或中性盐 小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤膜而分离
对抗血清的要求 抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。检查抗血清质量的指标主要
有亲和常数(K)、免疫交叉反应率及滴度(或抗体效价)。
对标记抗原的要求 (1)标记抗原的免疫活性与待测抗原及标准品必须一致。
(2)标记抗原要有适当高的放射性比活度。
(3)标记抗原应具有足够高的放射化学纯度
衡量抗体质量的指标
交叉反应率 ＝A50/B50×100％
B%
100 80
60
40 20
0 100 1000 10000 100000
抗血清稀释度
抗体滴度测定
五、放射免疫分析的设计方法
◆ 标讥抗原和抗体用量最佳化设计: 1、标记抗原用量选择。 2、抗血清的使用滴度选择及其方法。 ◆ 标准抗原剂量设计 1、标准抗原剂量范围 2、标准曲线工作范围 ◆ 加样顺序设计 ◆ 反应介质 ◆ 反应容积与温度及时间 1、缩小反应容积可相应减少抗体和标记抗原的绝对用量，使 非标记抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵敏度。 2 、抗原、抗体结合反应的平衡结合常数 K 与温度有关，必须 通过实验来确定最佳工作条件。 ◆ 与F分离方法选择 ◆ 样品采集与保存
第五节、放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA)
一、基本概念
同位素（isotope）：元素周期表中处于相同位置的某 种元素所包含的若干种核素。 放射性核素（radionuclide）：由于核内中子数和质子 数的比例不适而自发地发生核衰变，在衰变过程中将放 射出一种或几种射线而转变为别种核素的不稳定核素。