3第三章 动物细胞工程制药(2013.04.07)

4. 融合细胞系

细胞融合：指两个或两个以上的细胞合并
成一个细胞的过程

目前常用的融合方法有：仙台病毒融合法、
聚乙二醇融合法、电融合法
① 仙台病毒融合法（很少使用）
融合过程： a. 病毒加入两种细胞（4℃），附膜，细胞凝聚 b. 37℃，病毒与细胞膜反应，细胞膜被破坏 c. 两细胞连接部穿通，周边连接部修复 d. 细胞融合
② 必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免 即使是极微量的有害离子的掺入；
③ 保证有适量的氧气供应；
④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物；
⑤ 有良好的适于生存的外界环境； ⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度；
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
2. 水质 3. pH 4. 渗透压 5. 温度
第二节 动物细胞的形态和生理特性
一、动物细胞的形态
动物细胞属于真核细胞，形态各异，结构复
杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能。
根据不同的需要将离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型和贴壁非依赖型，或贴壁细胞和 悬浮细胞。
二、动物细胞的化学组成和代谢

动物细胞的主要化学组成
无机成分：水、无机盐 有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸
合同步、融合率高，可在显微镜下直接观察；
决定因素：电场强度、脉冲宽度、温度、缓冲液的
性质（pH、离子强度、渗透压）；
5. 重组工程细胞系

采用基因工程的手段构建各种工程细胞既
为重组工程细胞系.
三、基因工程细胞的构建和筛选
1.真核细胞基因表达载体的构建
病毒载体：如牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、杆 状病毒等 质粒载体：穿梭质粒载体
原始细胞库是单一来源的均质的细胞，对于二倍 体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。贮 存时须有该细胞的详细档案，包括：
① 该细胞系的历史：来源、年龄和性别、细胞分离
的方法、所用的培养材料等；
② 该细胞系的特性：形态、生长的特性、种源的特
性等； ③ 对各种有害因子检查的结果。

生产用细胞库：从原始细胞库来，或从单一安瓿
三、动物细胞的生理特点
4. 动物细胞对周围环境十分敏感 对理化因素敏感：如渗透压、pH、离子强度、剪 切力、微量元素等。 5. 动物细胞对培养基的要求高
必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄 糖、细胞生长因子、贴壁因子等。
6. 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌 不同
动物细胞生产药物
用。
去除微生物、有毒元素、金属离子、热原质 当前处理水质的方法有：蒸馏、离子交换、
电渗透、反渗透、中空纤Leabharlann Baidu过滤等。
3. pH

动物细胞培养的最适pH为7.2-7.4，低于6.8或高
于7.6会对细胞产生不利影响，严重时可引起细胞 退变甚至死亡。

培养基应具有一定的缓冲能力，必须加入缓冲系 统： 如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4缓冲系统、 NaHCO3/CO2缓冲系统等
电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。 特点：转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较
低
如何筛选工程细胞？
a. 依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系
统：如用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）
选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞；用G418
（Geneticin）选择系统，筛选neor的转化细胞。
缺点：培养条件高、成本贵、产量低
优点：分泌胞外、收集纯化方便，较完善的 翻译后修饰，与天然产品一致
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的要求
二、生产动物细胞的获得
三、基因工程细胞的构建和筛选
四、常用生产用动物细胞的特性
五、细胞库的建立
一、生产用动物细胞的要求
1. 原来只有从正常组织中分离的原代细胞才 能用来生产生物制品，如鸡胚细胞、兔肾 细胞等； 2. 二倍体细胞，即使经过多次传代也可用于 生产，如WI-38，2BS细胞等； 3. 用异倍体传代细胞生产重组基因产品，如 t-PA、EPO、Ⅷ因子等； 4. 按照FDA对细胞株的要求，控制最终产品中 DNA残留量
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
细胞融合法
化学法
物理法
显微注射法 基因枪法
病毒法
重组逆转录病毒介导法 重组DNA病毒介导法 多瘤病毒样颗粒介导法
DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 原生质融合法 染色体介导法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
5. 温度

动物细胞最佳培养温度：37±0.5℃
昆虫细胞最佳培养温度：27 ℃ 温度过高：细胞退变甚至死亡 温度过低：降低代谢和生长速度，影响产量
6. 空气
方瓶和转瓶培养时，保持瓶内有足够的空
间，即培养的液体量不超过总体积的30%。
采用生物反应器需通气，采用不同比例的O2、
N2、CO2和空气。
无毒、无污染

体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗 能力，因此培养基应达到：
无化学物质污染 无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等） 无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）

对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身， 应当严格选材，严格操作 对于合成培养基，污染主要来源于配臵过程，配制所用的水、 器皿应十分洁净，配臵后应严格过滤除菌。
用杆状病毒做载体的优点
① 该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组； ② 插入7-8kb的DNA不影响正常病毒粒子的形成； ③ 多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源 基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒 子； ④ 多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占 全部蛋白质的20-30%； ⑤ 用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选 阳性克隆；
② 聚乙二醇（PEG）融合法

常用相对分子量为1000，浓度为50%，pH 在8.0-8.2时融合率可达100% 目前主要用于产生单克隆抗体的杂交瘤细 胞的制备

③ 电融合法：在短时间的强电场作用下，细胞膜
发生可逆性的电击穿，使相邻细胞的细胞膜发 生继发性融合。
优点：操作简单，无化学毒性、对细胞损伤小、融
（3）Vero： 1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。 是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率 为1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为 199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种 病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被 批准用于人体。
（4）Namalwa： 1972年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病 人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞。 该细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有12-14
4. 渗透压

细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有 一定耐受性。 最理想的渗透压为290-300mOsm/kg

为调整培养液的渗透压，一般采用加减NaCl的方法：
1mg/ml NaCl---32mOsm/kg

在细胞培养操作中，为保持合适的渗透压和pH，一般都使 用平衡盐溶液（BBS），由无机盐和葡萄糖组成。
（2）BHK-21： 1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分 离的。现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的 方法经13次的克隆的细胞。
成纤维细胞，2n=44。通常用的培养基为
DMEM培养基，添加7%胎牛血清。过去多用于增殖 病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗， 现在已被用于构建工程细胞。

动物细胞的代谢 糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段
（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要 的中间产物，中间产物进入三羧酸循环）
三、动物细胞的生理特点
1. 细胞的分裂周期长：一般12-48 h 2. 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 接触抑制现象：指细胞在生长过程中达到相互接 触时停止分裂的现象。 3. 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的:时间长短 决定于细胞来源的种族和年龄 原代培养 有限细胞系 无限细胞系（连续细胞系）

二、动物细胞培养基的种类和组成
1.天然培养基

指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养 基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及 羊水、腹水等。
a. 磷酸钙沉淀法：将溶解的DNA加在Na2HPO4
中，逐渐加入CaCl2溶液，当 Na2HPO4和CaCl2形成 沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉 淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用 将DNA导入胞内。 优点：方法简单，可进行共转化
b. 电穿孔法：借助电穿孔仪产生的高压脉冲
6. 空气
1. 器材的清洗和消毒
（1）器材的清洗：
a. 浸泡（3%磷酸三钠）
b. 刷洗
c. 泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）
d. 冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水） （2）器材的消毒灭菌： 物理方法：如紫外线、干热、湿热、过滤 化学方法：如化学消毒剂、抗生素
2. 水质
细胞培养的水必须进行特殊的处理，才能使
生物技术制药
第三章 动物细胞 工程制药
中国十大名花（一）——牡丹
第一节 概述
Robert Hooke 及其制作的显微镜
Leeuwenhoek首次观察到了活的细胞
德国植物学家Schleiden和动物学家
Schwann创立了细胞学说
1885年Roux用生理盐水成功培养鸡胚组织 1907年Harrison成功培养了离体的蛙胚神
二、生产用动物细胞的获得
1. 原代细胞：直接取自动物组织、器官，经
过粉碎、消化而获得的细胞悬液。如鸡胚
细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、淋巴细
胞等；

用原代细胞生产生物制品常需要大量的动
物，费钱费力；
2. 二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，
从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有 一定特征的细胞株

由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组织 中获取（寿命更长）。如WI-38、MRC-5、2BS等
3. 转化细胞系：失去了正常细胞的特点，获
得了无限增殖的能力

转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时 间较短，对培养条件和生长因子等要求较
低，更适于大规模工业化生产。如Namalwa、
CHO、BHK-21、Vero细胞等。
⑥ 如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。
构建质粒载体一般含有如下基本成分： ① 允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ② 含有能使基因转录表达的调控元件。 ③ 能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 a. 仅适用于密切相关的突变细胞株，如tk基因 b. 显性作用基因，如neo基因 ④ 有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然 后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的
细胞库。

生产用细胞库也必须建立档案，而且需要进行无
菌性和无细胞交叉污染的检查，生产时需确定其
最高使用的传代数。
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
培养成功必备条件：
① 所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对 无菌，避免细胞外微生物的污染；
条标记染色体，单条X染色体，无Y染色体。通常用
的培养基为RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于大
规模生产-干扰素。
五、细胞库的建立
用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：
1. 原始细胞库（master cell bank， MCB）
2. 生产用细胞库（manugacture’s working cell bank，MWCB），或称工作细胞库 （working cell bank， WCB）。
b. 对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。
c. 利用扩增系统，不断增加其基因拷贝数，获得高
效表达而稳定的工程细胞株。
四、常用生产用细胞的特性
（1）WI-38：
1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二 倍体细胞系。 该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME（Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制在7.2。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50 代，上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
经组织，并观察到神经细胞突起的生长过
程。开创现代细胞培养的新纪元。
细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，
应用细胞生物学、分子生物学等理论和技 术，有目的地进行精心设计，精心操作， 使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达 到改良或产生新品种的目的，以及使细胞 增加或重新获得产生某种特定产物的能力， 从而在离体条件下进行大量培养、增殖， 并提取出对人类有用的产品。