大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

方法： 成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠 的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组 织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培 养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎 块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入 孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液， 加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消 化90 min，1 000 r/min离心10 min，使细胞沉 淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除 骨碎片。所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血 清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的 DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多 个25 cm2培养瓶。于37 ℃，含体积分数5%CO2 培养箱培养。48 h后换液，以后隔日换液1次。 成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过 程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度 长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。 将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞 悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。
碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞 接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min， 按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
Abstract
BACKGROUND: Tissue engineering requires a lot of seed cells. Osteoblasts have become an important seed cells in bone tissue engineering. However, there are the difficulties to derive osteoblasts and the different purity of osteoblasts was obtained. OBJECTIVE: To establish the methods of isolated culture and purification of neonatal rat calvarial osteoblasts, and to observe the biological characteristics of the osteoblasts from the skull. METHODS: Osteoblasts of Sprague-Dawley neonatal rats were primarily cultured and proliferated by the second enzyme digestion. Osteoblasts were purified by differential attachment method. Osteoblast proliferation and osteogenic activity were identified by morphology, alkaline phosphatase detection, Alizarin red staining and calcium nodules Von kossa staining, ultrastructure and cell proliferation curve. RESULTS AND CONCLUSION: Primarily cultured calvarial osteoblasts could proliferate by the secondary source of enzyme digestion. The amplification cells showed representative morphological and biological characteristics of osteoblasts. Alkaline phosphatase, Alizarin red staining and calcium nodules Von kossa staining presented positive results. Ultrastructural features appeared as high-differentiated active osteoblasts. Cell proliferation curves showed active cells. Results indicated that calvarial osteoblast of Sprague-Dawley rat has good proliferation and osteogenic activity and can be continuously passaged, with high purity, cell biological characteristics of stability. Calvarial osteoblast is suitable for experiment in vitro.
摘要
背景：组织工程需要大量的种子细胞，成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难，获得的 成骨细胞的纯度不一。 目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法，观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。 方法：采用二次酶消化法对 SD 大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养，扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、 细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节 Von kossa 法染色、超微结构以及细胞增殖曲线，确定其增殖与成骨活性。 结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖，传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活 性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节 Von kossa 法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞，细胞增 殖曲线显示细胞生长活跃。提示，新生 SD 大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性，能连续传代增殖，纯度高， 细胞生物学特征稳定，适用于做体外实验研究。 关键词：成骨细胞；组织工程；原代培养；鉴定；形态学
Li Xiao-feng★, Master, Attending physician, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China xiaofengli74@ 163.com
成骨细胞鉴定：
活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置 相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍 照。
Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整 细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板 中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细 胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇 固定10 min，Giemsa染液染2 min，蒸馏水冲 洗，显微镜下观察拍照。
Primary culture and identification of rat osteoblasts
Li Xiao-feng, Zhao Jin-min, Su Wei, Fan Qie, Luo Shi-xing, Ma Ai-guo
Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
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990
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李晓峰，等. 大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定
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验中心提供，许可证号：SCXK(桂)2009-0002。 实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国 科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物 的指导性意见》标准[2]。
用二次酶消化法，应用碱性磷酸酶、钙化结节 染色、电镜超微结构观察鉴定成骨细胞，以生 长曲线进行成骨细胞增殖能力鉴定。期望建立 一种简单、快速、成活率高和纯度高的原代培 养方法，以获得大量成骨细胞，为骨组织工程 提供足够的种子细胞提供理论依据和实践经 验。
1 材料和方法
设计：细胞形态学与生物学特性实验。 时间及地点：于2009-07/2010-01在广西 医科大学基础医学院中心实验室完成。 材料：取新生24 h内SD大鼠乳鼠20只，不 计体质量、不分雌雄，由广西医科大学动物实
Supported by: the Key Scientific Research Program of Medical Health of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 200636*
Received: 2010-07-23 Accepted: 2010-11-20
Correspondence to: Zhao Jin-min, Doctor, Professor, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China zhaojinmin@126.com
实验用试剂与仪器：
试剂及仪器
H-DMEM 培养基、胎牛血清 胰蛋白酶、青霉素、链霉素、
Ⅱ型胶原酶 H-500 型透射电子显微镜 JSW-T300 扫描电镜 SW-CJ 型生物洁净工作台 CO2 培养箱 倒置相差显微镜
来源
Gibco Sigma
HITACHI JEOL 苏净集团安泰公司 Shellab Olympus
中国组织工程研究与临床康复 第 15 卷 第 6 期 2011–02–05 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research February 5, 2011 Vol.15, No.6
大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定*★
李晓峰，赵劲民，苏 伟，范 锲，罗世兴，马爱国
Li XF, Zhao JM, Su W, Fan Q, Luo SX, Ma AG. Primary culture and identification of rat osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(6):990-994. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]
0 引言
组织工程是研究、开发用于修复、维护、 促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态 的生物替代物的一门新兴学科。组织工程需要 大量的种子细胞，成骨细胞已成为骨组织工程 构建的重要种子细胞之一。随着组织工程学的 发展，成骨细胞的体外培养已成为骨组织工程 体外构建研究的基础。因成骨细胞包绕在致密 组织中，致使取材困难，虽然用组织块法、酶 消化法、骨膜组织块法、骨髓组织块法以及薄 层骨片经EDTA处理并经胶原酶消化均可分离 培养出成骨细胞,但是获得的成骨细胞的纯度不 一[1]。实验采用新生乳鼠颅盖骨做试验材料，采
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.06.010
李晓峰，赵劲民，苏伟，范锲，罗世兴，马爱国. 大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，
15(6):990-994.
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