乙肝疫苗的制备PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 选择分离纯化方法的依据
• 根据产物表达形式来选择 • 根据分离单元之间的衔接来选择 • 根据分离纯化工艺的要求来选择
.
16
分离纯化工艺流程
.
17
• 1、发酵液的预处理
• 连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩
• 2、疏水柱层析
• 介质： Butyl S Sepharose FF • 加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液
基因工程
－乙肝疫苗的制备
演 讲 者： 鞠 林
PPT 制 作者：杨秀兰 李翠华 欧永银
向运新 李凯 周永斌
彭博 王伟杰
朱晓东
资料提供者：
刘珍
鞠林
基因工程
定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过 载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一 种遗传学操作。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状 并能稳定遗传。
蛋白质的分离纯化
.
14
• 浓缩与初步纯化
• 离子交换层析 • 疏水层析 • 亲和层析
• 固液分离
• 离心沉淀 • 膜过滤 • 双水相萃取
• 高度纯化
• DNA的去除 • 热原质的去除 • 病毒的去除
.
15
• 分离纯化的基本要求
• 技术条件温和，保持其生物活性 • 选择性好，达到有效分离纯化的目的 • 技术间可以直接连接，节省工艺步骤 • 收率高，过程快
.
4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
.
5
• 基因重组乙肝疫苗
用基因重组技术把乙型肝炎病毒的表面抗原 （HbsAg）基因片段插入酵母细胞或哺乳动物 细胞的基因中，在体外培养增殖过程中组装或 分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收 集起来提纯之后做成乙型肝炎疫苗。
.
6
乙肝疫苗的制备
.
7
目的基因的获取
编码乙型肝炎表c面D抗N原A的文基因库的获取 一般的目的基因的获取的方法建有立： ？
反转录法 化学合成法 反转录—聚合酶链反应法
.
8
cDNA文库的建立
.
9
工程菌的构建
• CHO细胞的特点
• ①具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药 物蛋白 在分子结构、理化特性和生物学功能方面最 接近于天然 蛋白分子
• ②具有产物胞外分泌功 能 ,便于下游产物分离纯化; • ③具有重组基因的高效 扩增和表达能力; • ④具有贴壁生长特性 ,且有较高的 耐受剪切力和渗透压
电导率相等 • 按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低
硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析
.
18
• 3、阴离子交换柱层析
• 介质：DEAE Sepharose FF
• HBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐换液， 使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一 致
• 按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度 分段洗脱、清柱再生程序层析
作用：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体 细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。某一 段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了 可能.
获得目的基因
表达载体
酶切、连接
重组的表达载体
转化、转染等
宿主细胞
原核生物细胞
植物细胞
动物细胞
人类细胞
转基因 微生物
• 生长激素(growth hormone)
促进生长
• 生长激素释放因子(growth hormone releasing factor) 促进生长
• 胰岛素(insulin)
治疗糖尿病(diabetes)
• 干扰素(interferon)
抗病毒抗肿瘤
• 白细胞介素(interleukin)
治疗癌症
.
11
• 主要试剂
• 限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取 和柱式胶回收试剂盒 • 乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 • DMEM 和透析胎牛血清 • 胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体
Lipofectamine TM • HBsAg 血凝检测试剂盒
.
12
目的基因的表达
.
13
基因工 程药物
转基因植物 培养的动 物细胞
卵细胞
胚胎 发育
基因 治疗
药物、疫苗
转基因动
.
3物
• 蛋白质名称
用途
• 促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone） 治疗风湿（rheumatic disease）
• B细胞生长因子（B-cell growth factor） 调
能力 ,可以进行悬浮培养 ,表达 水平较高; • ⑤CHO 细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身
的内源蛋白 ,利于外源蛋白的后分离
.
10
• 材料
• 菌株﹑质粒及细胞 • 大肠杆菌 DH5α 和质粒 pMD18-Sm（携带改变稀
有密码子后的 S 基因） • 质粒 pCIneo • CHO ／ dhfr-细胞 • pMD18-T 载体
.
19
• 4、凝胶过滤柱层析
• 介质：Sepharose 4 FF • 超滤浓缩到适当体积 • 按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析
• 5、除菌
• 收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品
.
20
谢谢观赏
治疗免疫系统功能失
• 降钙素(calcitonin)
治疗软骨病
(osteomalacia)
• 集落刺激因子(colony stimulating factor) 助治疗
治疗血液病、肿瘤辅
• 绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin)
治疗不排卵症
• 内啡肽和脑啡肽(endorphine and enkephalin)
镇痛剂(analgesic agent)
• 上皮生长因子(epidermal growth factor)
促进伤口愈合
• 红细胞生成素(erythropoietin)
治疗贫血(anemia)
• 凝血因子Ⅷ(factor Ⅷ)
治疗血友病
(hemophilia)
• 凝血因子Ⅸ(factor Ⅸ)
治疗血友病
• 根据产物表达形式来选择 • 根据分离单元之间的衔接来选择 • 根据分离纯化工艺的要求来选择
.
16
分离纯化工艺流程
.
17
• 1、发酵液的预处理
• 连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩
• 2、疏水柱层析
• 介质： Butyl S Sepharose FF • 加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液
基因工程
－乙肝疫苗的制备
演 讲 者： 鞠 林
PPT 制 作者：杨秀兰 李翠华 欧永银
向运新 李凯 周永斌
彭博 王伟杰
朱晓东
资料提供者：
刘珍
鞠林
基因工程
定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过 载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一 种遗传学操作。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状 并能稳定遗传。
蛋白质的分离纯化
.
14
• 浓缩与初步纯化
• 离子交换层析 • 疏水层析 • 亲和层析
• 固液分离
• 离心沉淀 • 膜过滤 • 双水相萃取
• 高度纯化
• DNA的去除 • 热原质的去除 • 病毒的去除
.
15
• 分离纯化的基本要求
• 技术条件温和，保持其生物活性 • 选择性好，达到有效分离纯化的目的 • 技术间可以直接连接，节省工艺步骤 • 收率高，过程快
.
4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
.
5
• 基因重组乙肝疫苗
用基因重组技术把乙型肝炎病毒的表面抗原 （HbsAg）基因片段插入酵母细胞或哺乳动物 细胞的基因中，在体外培养增殖过程中组装或 分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收 集起来提纯之后做成乙型肝炎疫苗。
.
6
乙肝疫苗的制备
.
7
目的基因的获取
编码乙型肝炎表c面D抗N原A的文基因库的获取 一般的目的基因的获取的方法建有立： ？
反转录法 化学合成法 反转录—聚合酶链反应法
.
8
cDNA文库的建立
.
9
工程菌的构建
• CHO细胞的特点
• ①具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药 物蛋白 在分子结构、理化特性和生物学功能方面最 接近于天然 蛋白分子
• ②具有产物胞外分泌功 能 ,便于下游产物分离纯化; • ③具有重组基因的高效 扩增和表达能力; • ④具有贴壁生长特性 ,且有较高的 耐受剪切力和渗透压
电导率相等 • 按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低
硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析
.
18
• 3、阴离子交换柱层析
• 介质：DEAE Sepharose FF
• HBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐换液， 使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一 致
• 按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度 分段洗脱、清柱再生程序层析
作用：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体 细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。某一 段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了 可能.
获得目的基因
表达载体
酶切、连接
重组的表达载体
转化、转染等
宿主细胞
原核生物细胞
植物细胞
动物细胞
人类细胞
转基因 微生物
• 生长激素(growth hormone)
促进生长
• 生长激素释放因子(growth hormone releasing factor) 促进生长
• 胰岛素(insulin)
治疗糖尿病(diabetes)
• 干扰素(interferon)
抗病毒抗肿瘤
• 白细胞介素(interleukin)
治疗癌症
.
11
• 主要试剂
• 限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取 和柱式胶回收试剂盒 • 乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 • DMEM 和透析胎牛血清 • 胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体
Lipofectamine TM • HBsAg 血凝检测试剂盒
.
12
目的基因的表达
.
13
基因工 程药物
转基因植物 培养的动 物细胞
卵细胞
胚胎 发育
基因 治疗
药物、疫苗
转基因动
.
3物
• 蛋白质名称
用途
• 促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone） 治疗风湿（rheumatic disease）
• B细胞生长因子（B-cell growth factor） 调
能力 ,可以进行悬浮培养 ,表达 水平较高; • ⑤CHO 细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身
的内源蛋白 ,利于外源蛋白的后分离
.
10
• 材料
• 菌株﹑质粒及细胞 • 大肠杆菌 DH5α 和质粒 pMD18-Sm（携带改变稀
有密码子后的 S 基因） • 质粒 pCIneo • CHO ／ dhfr-细胞 • pMD18-T 载体
.
19
• 4、凝胶过滤柱层析
• 介质：Sepharose 4 FF • 超滤浓缩到适当体积 • 按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析
• 5、除菌
• 收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品
.
20
谢谢观赏
治疗免疫系统功能失
• 降钙素(calcitonin)
治疗软骨病
(osteomalacia)
• 集落刺激因子(colony stimulating factor) 助治疗
治疗血液病、肿瘤辅
• 绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin)
治疗不排卵症
• 内啡肽和脑啡肽(endorphine and enkephalin)
镇痛剂(analgesic agent)
• 上皮生长因子(epidermal growth factor)
促进伤口愈合
• 红细胞生成素(erythropoietin)
治疗贫血(anemia)
• 凝血因子Ⅷ(factor Ⅷ)
治疗血友病
(hemophilia)
• 凝血因子Ⅸ(factor Ⅸ)
治疗血友病