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第11卷　第12期中华男科学杂志
Vol .11　No .12
2005年12月
Nati onal Journal of Andr ol ogy
Dec .2005
・论著・
人精原干细胞的体外培养及其功能鉴定
李彦锋
1,2
,郭应禄2,李晓红3,靳凤烁1,孙中义
1
(1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科,重庆400042;北京大学第一医院,
2.泌尿外科研究所,
3.生殖和遗传医疗中心,北京100034)
摘要:　目的:通过应用多种培养条件下的生殖细胞共培养体系,寻求人精原干细胞(SSC )长期体外生存和扩增的
优化途径。

　方法:应用磁式分选所获得的α6+Thy 2
1+c 2kit -细胞,分别以ST O 、M EF 、Sert oli 细胞为饲养层,于DME M /F12、DME M 或DM E M 2SF 培养液条件下短期培养,然后选择胎儿Sert oli 细胞作为共培养体系,在32℃、5%CO 2、DME M /F12(含10%胎牛血清)培养条件下,分别观察成人和胎儿生殖细胞的长期培养结果。

并应用免疫组
化技术和SSC 移植技术对培养细胞进行初步生物学特性和功能鉴定。

　结果:在短期培养中,α6+Thy 21+c 2kit -细
胞在存在饲养层时,可在DME M 和DM E M /F12培养液中稳定生存,1周内存活率可达90%。

长期培养条件下,α6+
Thy 21+
c 2kit -
细胞逐渐与Sert oli 细胞形成紧密的贴附或镶嵌关系,呈单个、成对、短链状或小团簇状;胎儿SSC 与成
人类似,部分以圆球形散在分布于Sert oli 细胞表面,并常可观察到明显的成对或短链状细胞,部分呈有突起的长梭形扁平细胞,与Sert oli 细胞相互形成紧密连接;经反复传代3个月,仍可观察到稳定存在的圆球形SSC 贴附于Ser 2
t oli 细胞表面。

由PKH26标记的α6+
Thy 21+
c 2kit -
细胞在移植后2个月可迁移至裸鼠生精小管基膜,表现为单个或
成对的细胞。

生精小管内荧光细胞计数显示α6+Thy 21+c 2kit -细胞在体外培养2、4周后仍然保留54.9%和9.2%的
SS C 。

　结论:该培养系统的进一步优化将有利于体外产生大量SSC,并有助于进一步深入了解SS C 的生物学特性
和男性生精功能障碍的治疗。

关键词:精原干细胞;睾丸;移植;细胞培养,体外;人
中图分类号:R321+.1 文献标识码:A 文章编号:100923591(2005)1220886206
Long 2term Survival of Human Spermatogon i a l Stem Cells in vitro and Its Functional Identification
L I Yan 2feng 1,2
,G UO Ying 2lu 2
,L I Xiao 2hong 3
,J I N Feng 2shuo 1
,S UN Zhong 2yi
1
1.D epart m en t of U rology,Institute of F ield Surgery,D aping Hospita l,the Th ird M ilitary M ed ical U niversity,
Chongqing 400042,China;2.Institute of U rology,3.R eproductive and Genetic Cen ter ,The F irst Hospital,Peking U niversity,B eijing 100034,China
Correspondence to:J I N Feng 2shuo,E 2m ail:fengshuojin @hot m a il .co m
Abstract:　O bjective:The culture of hu man s per mat ogonial ste m cells (SSC )has not been studied in detail yet .Here we tried t o ex 2
p l ore the op ti m ized culture method of hu man SSC by using several different co 2culture syste m s .　M ethods:The α6+Thy 21+c 2kit -cells
acquired by the i m munomagnetic beads s orting technique were cultured in different co 2culture system s .Their mor phol ogical,bi ol ogical characteristics and survival rates were intensively observed by m icr oscop ic or i m munocyt oche m ical assay .The l ong 2ter m survival rate of hu man SSC during culture peri od was evaluated by ger m cell trans p lantati on technique .　R esu lts:The α6+
Thy 21+
c 2kit -
cells could stably survive in the DM E M and DME M /F12mediu m swith fetal bovine seru m (F BS )on feeder layer .The survival rateswithin 1week
・688・收稿日期:2005205228;修回日期:2005209209基金项目:国家自然科学基金资助(30200093)
作者简介:李彦锋(19682),男,山西长子县人,副主任医师,副教授,医学博士,从事男性生殖和避孕疫苗研究。

E 2mail:lyf1000@yahoo .co m .cn 通讯作者:靳凤烁,E 2mail:fengshuojin@hot m ail .com
were more than90%.The l ong2ti m e culture showed the cells were gradually attached on the surface of Sert oli cells by the manner of scattered single cell or accu mulated masses.Part of the SSC beca me more tightly attach ment with Sert oli cells or mounted a mong the Sert oli cells.They could survive or even p r oliferate f or more than3months in vitro.Ger m cells trans p lantati on study showed that s ome α
6
+Thy21+c2kit-cells labeled by PKH26could resided on the basal me mbrane of sem inifer ous tubule of nude m ice,appearing as sin2 gle or coup led cells2months later after trans p lantati on.The functi on evaluati on of the cultured cells by counting the fluorescent cells in the se m inifer ous tubule showed54.9%and9.2%of SS C in theα6+Thy21+c2kit-cells were still re mained after cultured for2and4 weeks,res pectively.　C onclusion:Hu man SSC could maintain survival in vitro f or more than3months,but it was still need t o seek for a more op ti m ized and successful culture syste m for its efficient expansi on and p r oliferati on.Thus it will open up a wide p r os pect f or the understanding of the bi ol ogy of hu man SSC and the treat m ent of male sterility.　N a tl J A ndrol,2005,11(12):8862890,894
Key words:s per mat ogonial ste m cell;testis;trans p lantati on;cell culture,in vitro;hu man
建立人精原干细胞(s per mat ogonial ste m cells, SSC)的长期稳定体外培养体系,有助于研究精子发生的调控机制,为应用辅助生育技术治疗男性精子发生障碍提供可能。

多年来,应用多种培养系统不断摸索培养不同种属精原细胞的条件和方法,然而一直未能建立稳定的SSC或精原细胞长期培养体系。

近年来,随着生殖细胞移植技术的出现,为SSC 的功能鉴定提供了可靠的研究策略,有力推动了对SSC体外培养研究的深入。

但目前对人SSC体外培养研究极为少见。

本实验选用正常成人睾丸和胎龄6个月以上的睾丸,经过磁式细胞分选或Percoll不连续梯度离心分离富集人SSC,应用多种不同的培养液和饲养层细胞对所分离和分选后人睾丸生殖细胞进行体外培养,并对其培养条件下的形态学特征和免疫组化特性进行了初步观察和鉴定,获得人SSC的长期体外生存和扩增。

1　材料与方法
1.1　标本来源　生精功能正常成人新鲜睾丸组织20例,年龄21～35岁,平均26.4岁。

17例胎儿睾丸组织,胎龄6～9个月,平均6.9个月。

1.2　实验动物和细胞　ST O细胞株由上海第九人民医院组织工程研究中心惠赠;昆明小鼠3只由第三军医大学大坪医院实验动物所提供;雄性裸鼠36只,4～6周龄,购自中国科学院上海实验动物中心。

1.3　主要试剂　DME M培养液,DME M/F12培养液(GI B CO BRL公司);孕马血清促性腺激素(P MSG,天津高新生物技术公司);兔抗人SSEA21单抗(1∶25)(DAK O公司);鼠抗人OCT24单抗(1∶25) (Santa Cruz公司);转铁蛋白,Na
2
Se O3,睾酮,雌二醇,丝裂霉素C,胰蛋白酶,大豆胰蛋白酶抑制剂(Sig2 ma公司);卵泡刺激素(FS H,瑞士雪兰诺公司)。

1.4　DME M2SF培养液(无血清DME M)配制　DME M培养液中加入100ng/m l的FSH、2μg/m l的胰岛素、5μg/m l的人转铁蛋白、50ng/m l维生素A、200ng/m l维生素E、1×10-9mol/L氢化可的松、10 ng/m l上皮生长因子、1×10-8mol/L睾酮、1×10-8 mol/L雌二醇、2mmol/L谷酰胺、5ng/m l硒酸钠、1 mmol/L丙酮酸钠、22mmol/L乳酸钠,并加入青霉素(100U/m l)、链霉素(100U/m l)和氟康唑(5μg/m l),调整pH值至7.2,0.22μm滤膜过滤除菌。

分装后于-20℃冰箱存放备用。

另外培养时每日供给50ng/m l的维生素C。

1.5　方法
1.5.1　培养条件及分组
1.5.1.1　成人SSC的短期培养　首先选择α6+
Thy21+c2kit-细胞在32℃、5%CO2恒温培养箱中进行短期培养,共分为9组,分别在以Sert oli、ST O、MEF细胞为饲养层的培养体系下,均以2×105/c m2细胞密度分别在DME M(含10%FCS)、DME M/F12 (含10%FCS)、DME M2SF培养液中进行1～7d培养,每周换液2～3次。

由于α
6
+Thy21+c2kit-细胞在初期培养中大部分处于悬浮或未贴壁状态,故换液时须离心后将悬浮细胞重新加入培养体系中。

每种条件下的培养重复进行3次。

1.5.1.2　成人及胎儿SSC的长期培养观察　根据上述短期培养的观察结果,选择与人胎儿Sert oli细胞作为共培养体系,应用DME M/F12(含10%FCS)
培养液,在32℃、5%CO
2
培养条件下,分别观察分选或分离后成人和胎儿生殖细胞的长期培养结果。

1.5.2　培养细胞的形态学特性和细胞存活率的计数　根据文献对其他种属SSC的形态学特征描述[124],每日于倒置相差显微镜下观察和分析人分选后细胞的形态学特征和生长情况。

长期培养时,视细胞生长情况8～10d传代1次。

在短期培养中,取培养瓶行轻柔震荡后,取出1滴细胞悬液,加入5μl0.4%锥虫蓝混匀,在5m in内于倒置相差显微镜下用血球计数板分别观察计算每微升细胞悬液中的活细胞数及细胞总数,每例标本重复3次观察计数。

・
7
8
8
・
第12期 李彦锋等　人精原干细胞的体外培养及其功能鉴定
1.5.3　免疫细胞化学染色　在培养皿中预先加入
涂有多聚赖氨酸的盖玻片,细胞培养至适当时间后,
取出盖玻片,75%乙醇固定;或将处于未贴壁状态的细胞经P BS 洗涤后,涂于已行多聚赖氨酸处理的载玻片上,同法固定,按常规免疫组化ABC 方法进行染色。

选择SSE A 21单抗对培养的胎儿睾丸SS C 进行鉴定,选择抗β1整合素、抗α6单抗和抗OCT 24单抗对培养的成人睾丸SS C 进行初步生物学特性鉴定。

1.5.4　SSC 移植　受鼠移植前准备,供者细胞的荧光标记,显微注射移植方法(睾丸网注射法)及受鼠睾丸分析均采用本研究前期建立的方法[5]。

1.6　统计学分析　各组计量资料均以x ±s 表示。

对不同共培养体系和培养液条件下短期培养不同时间后各组间的活细胞比率进行了统计分析,采用u 检验。

检验结果以P <0.05为相差非常显著。

SSC 移植结果以每注射1×106
个供者睾丸细胞所获得的
睾丸内红色荧光细胞数进行标准化,利用SPSS 11.0
统计软件进行t 检验。

2　结果
2.1　成人SSC 在培养条件下活细胞比率比例随时
间变化情况　以DME M 2SF 作为培养液的3种不同
共培养体系在经过1周的培养后,α6+Thy 21+c 2kit
-细胞活细胞比率均呈减少趋势,组内前后对照分析表明差异非常显著(P <0.01)。

而以DM E M /F12或DM E M 作为培养液的3种共培养体系在经过1
周培养后,α6+Thy 21+c 2kit -细胞活细胞比率组内
前后比较均无明显变化(P >0.05),而且各组间活细胞比率差异亦无显著性(P >0.05)。

但以Sert oli 细胞为饲养层、DM E M /F12为培养液条件下的培
养体系,α6+Thy 21+c 2kit -细胞总体活细胞比率最高。

见表1。

表1　在不同培养体系条件下SSC 培养24h 、72h 和1周后活细胞比率变化(%)
Table paris on of SSC survival rates under different cultural conditi ons f or 24h,72h and 1week (%)
Cultural ti m e
Co 2culture Sert oli cells
DME M DME M /F12DME M 2SF ST O cells
DME M DME M /F12DME M 2SF MEF cells DME M DME M /F12DME M 2SF 24h 94.096.892.693.596.490.794.895.087.972h 94.995.482.3392.395.778.3394.595.379.031w
93.3
95.3
52.1△
92.0
91.4
55.3△
89.7
94.9
48.7△
与相应共培养体系培养24h 时相比,3:P <0.01;与相应共培养体系培养24h 、72h 时相比,△:P <0.01
Co mpared with cultrual 24h in co 2cultural syster m,3:P <0.01;co mpared with cultural 24h and 72h in co 2culture syste m,△:P <0.01
2.2　SSC 的长期培养观察
2.2.1　成年SSC 长期观察结果　成人睾丸组织中
从形态学推测的SSC 在培养1周内,均主要呈圆球形或卵圆形,轮廓清晰,立体感强,折光率较大,体积中等偏大,直径约16～20μm ,胞质均质,呈细颗粒状,胞核也呈均质状,无异染色质,一般以单个散在、多个聚集或团簇状方式松散附着于多突起的Sert oli 细胞上,部分SSC 呈悬浮状存在但活力良好。

随着培养时间的延长,在培养2周后,部分SSC 细胞与Sert oli 细胞形成紧密的贴附关系或镶嵌于Sert oli 细胞之间,呈现为单个、成对、短链状或小团簇状形式,并有部分细胞呈不规则梭形或葡萄串状(图1A ),但仍有少量SSC 呈悬浮状存在;培养3～4周后,SSC 在培养体系中与Sert oli 细胞形成稳定紧密的联系或镶嵌于Sert oli 细胞之间,呈葡萄串状、条索状或团簇状,在培养液中已较少存在悬浮状态的SSC 活细胞,培养体系表现为一种稳定状态(图1B )。

在传代后,该种共培养体系可迅速在3～5d 内恢复上述稳定
状态,可见具有上述SSC 形态特征的细胞持续存在,
但呈逐渐缓慢减少趋势。

尽管未能观察到上述细胞的大量扩增,但在体外SSC 可长期存活并可见明显成对出现的原始细胞。

图1　成人睾丸α6+Thy 21+c 2kit -细胞与Sert oli 细胞共同培
养2、4周后(A,B )形态(SP,×100)
Figure 1.The hu man adult testis α6+Thy 2
1+c 2kit -cells after 2and 4weeks co 2culture with Sert oli cells (A,B )(SP,×100)
2.2.2　胎儿SSC 长期观察结果　在胎儿睾丸组织SSC 与Sert oli 细胞共培养体系中,SSC 可在Sert oli
细胞表面长期存活并观察到明显的SSC 分裂现象。

共同培养24h 后,Sert oli 细胞大部分贴壁并开始有
・
888・中华男科学杂志2005年12月　第11卷
明显伪足形成,呈星状、梭形或扁平样细胞。

部分SSC 开始贴附于Sert oli 细胞表面或附近,呈圆球状,胞质均匀,核大清晰,同时亦可观察到较多量SSC 未能贴壁而悬浮于培养液中。

1周后,可见存活的SSC 均稳定地贴附于已形成一层单层的Sert oli 细胞的表面,呈散在的单个、成对或团簇状的圆球形、椭圆形细胞,核大而清晰,并可观察到1～2个核仁。

随着培养时间的延长,可观察到SSC 呈现2种不同的形态学特征:第一,部分SSC 仍持续以圆球形散在分布于Sert oli 细胞表面,并常可观察到明显的成对或短链状细胞(图2A );第二,部分SSC 呈现为具有突起的长梭形扁平细胞,并与Sert oli 细胞相互形成紧密连接,呈现为密集的细胞群,遍布于培养瓶底部。

但此时SSC 仍可见明显清晰的核及细胞轮廓,与Sert o 2li 细胞显著不同,容易彼此分辨(图2B )。

在3～4周培养后,整个培养体系呈现一种相对稳定的状态,无明显脱壁、死亡的细胞。

在长期培养过程中可持续观察到较多成对出现的SSC,与成人睾丸SSC 的共同培养体系中所见极为相似。

本实验对在该种共同培养条件下培养的细胞每隔10d 进行传代1次,经反复传代10次,仍可在培养瓶中观察到稳定存在的少量圆球形SSC 贴附于Sert oli 细胞表面。

图2　胎儿睾丸精原细胞与Sert oli 细胞共同培养2、4周后
(A,B )形态(SP,×200)
Figure 2.
The fetus testis s per mat ogonial cells after 2and 4
weeks co 2culture with Sert oli cells (A,B )(SP,×200)
2.3　免疫组化结果　长期培养后,同培养前的免疫
组化染色特征相似,仍存在大量α6、
β1整合素和OCT 24阳性细胞(图3A 、B 、C )。

经Percoll 分离后的胎儿未分化精原细胞,SSEA 21免疫组化染色显示大部分均呈SSEA 21阳性染色,表现为细胞呈棕黄色深染。

经过4周体外培养后所获得的细胞经SSE A 21免疫染色,结果显示仍有多数细胞存在明显阳性染色(图3D )。

2.4　成人睾丸SSC 长期培养前后的功能性评价　
培养初期成人睾丸α6+Thy 21+c 2kit -
细胞移植获得
的荧光细胞或克隆数为(480.0±25.0)/106
培养初期睾丸细胞(n =6);培养2周及4周后,供者来源的
图3　成人睾丸α6+Thy 2
1+c 2kit -细胞培养2周后的OCT 24、α6、
β1整合素免疫染色及人胎儿Percoll 分离的未分化精原细胞培养4周后SSE A 21免疫染色(×100)
Figure 3.The i m muno 2hist ochem istry stainings of the OCT 24,
α6,β1integrin of the hu man adult α6+Thy 21+c 2kit -cells after 2
weeks co 2culture and the SSE A 21of the fetus s per mat ogonial cells is olated by Percoll after 4weeks co 2culture (×100)
荧光细胞或克隆数分别显著降低为(263.3±23.0)/
106
培养初期睾丸细胞(P <0.01)和(44.0±5.1)/106
培养初期种植的睾丸细胞(n =6,P <0.01)。

该结果显示在培养2周后仍保留54.9%的干细胞,培养4周后仍保留9.2%的干细胞。

2.5　胎儿睾丸SSC 长期培养前后的功能性评价　培养初期胎儿精原细胞移植获得的荧光细胞或克隆
数为(139.2±12.2)/106
培养初期睾丸细胞(n =6);在培养2周及4周后,供者来源的荧光细胞或克
隆数分别显著降低为(86.7±8.6)/106
和(20.5±
1.1)/106
培养初期睾丸细胞(P <0.01)。

该结果显示在培养2周后仍保留62.3%的干细胞,培养4周后仍保留14.7%的干细胞。

胎儿SSC 在体外培养2、4周后,所保留的SSC 比例与成人相比差异均无显著性(P >0.05)。

3　讨论
至今国内外研究已初步建立了不同种属动物睾
丸精原细胞的多种体外培养系统,包括组织培养和细胞培养两大类。

在多种动物胚胎干细胞(ES )和睾丸SSC 等干细胞研究中,细胞体外培养均需要适
当饲养层细胞的存在[1,6]。

通常选择的饲养层细胞多为MEF 、ST O 、人胚胎成纤维细胞(hu man e mbryon 2ic fibr oblast,HEF )、Sert oli 细胞等,这些饲养层细胞可为干细胞提供多种必要的细胞因子和递质,它们与干细胞之间的相互作用是干细胞体外生存的重要
条件[729]。

本研究结合多种不同的培养体系对人SSC 的体
・
988・第12期 李彦锋等　人精原干细胞的体外培养及其功能鉴定
外培养进行了观察研究。

为了对比分析人SSC在不同培养体系中的生存和扩增的状况,寻求稳定的体外培养体系,本实验应用3种不同的共培养体系,并在3种不同培养液条件下,对比观察了人睾丸磁式分选后细胞体外短期和长期培养的结果。

发现人生殖细胞可以在相对较为简单的培养条件下稳定生存,培养液中无需加入生长因子、激素或其他非常用成分。

在加入10%胎牛血清时,无论以MEF、ST O 或Sert oli细胞为饲养层,成人生殖细胞均可在DME M、DME M/F12培养液中较稳定地存活,且数量相对稳定。

培养1周,其活细胞比率仍达到90%以上;但在无血清培养液DME M2SF中培养时,无论在何种饲养层中培养,生殖细胞在短期内(1～7d)均有大量死亡,活细胞丢失至原来数量的1/2。

Sert oli 细胞和生殖细胞共同培养时,其生殖细胞的存活率与应用ST O、MEF细胞作为饲养层时结果相似。

Sert oli细胞对生殖细胞存活的促进效应表明其分泌的生长因子和细胞因子[6]及其与生殖细胞间的相互作用,对于生殖细胞的体外生存和扩增具有良好的维持作用。

由于Sert oli细胞能够分泌免疫保护因子、多种生长因子和营养因子,如:I GF、bFGF、TGFα、TGFβ、EGFα、EGFβ等[10],已有人将Sert oli细胞与其他种类的细胞(如大鼠胎脑多巴胺能神经元细胞、猪胰腺细胞)进行联合培养,以提高培养细胞的生存状态,促进此类细胞的生长及增殖[11,12];亦有研究将Sert oli细胞与其他种类细胞(如牛的嗜铬细胞、猪的胰岛细胞)进行联合移植,以提高移植细胞的存活率及降低免疫排斥反应[12]。

可见Sert oli细胞对于多种细胞的生存和扩增均具有重要促进作用。

在长期培养观察中,我们发现成人和胎儿睾丸SSC体外生存特性具有极大的相似性,即在培养早期数天内均呈悬浮状态存在,逐渐以单个散在形式或多个聚集成团状方式松散附着于多突起的Sert oli 细胞上,随着培养时间的延长,部分SSC与Sert oli 细胞形成紧密的贴附关系或镶嵌于Sert oli细胞之间,呈现为单个、成对、短链状或小团簇状球形细胞,并有部分细胞逐渐演变为不规则梭形或葡萄串状。

在3～4周后,培养仍能够保持相对稳定的状态。

在培养4周后,成人和胎儿生殖细胞的外观仍极为相似,但胎儿睾丸生殖细胞培养后的圆形细胞数量明显多于成人分选后睾丸细胞,同时胎儿睾丸SSC向Sert oli细胞附着的过程比成人SSC更为迅速,且在体外维持的时间更为长久和稳定。

长期以来人们认为大部分生殖细胞在体外培养环境下存活数周时间后,即从培养体系中很快消失。

早期由于缺乏干细胞活性的功能性测定方法,因而
阻碍了对体外维持培养细胞的准确评价。

在本实验中,我们首先应用α
6
、β
1
整合素、OCT24、SSE A21单抗对培养细胞的生物学特性进行了初步观察,结果证实成人睾丸分选后细胞和胎儿睾丸经Percoll分
离后细胞培养4周仍可观察到明显α
6
、β
1
整合素及OCT24阳性染色或SSEA21阳性染色,明确地提示SSC可在体外长期存活。

众所周知,在体内,精子发生的干细胞对许多有害环境因子具有显著抵抗和耐受性,是最后被放射线、抗癌剂、热或其它睾丸损伤物破坏的生殖细胞。

因此,可能体外环境下这些细胞和在体内特性相似,能够维持最持久的生存。

小鼠生殖细胞移植研究和SSC冷冻保存的研究也证实这些干细胞能够抵抗苛刻条件[13]。

在对SSC与Sert oli细胞共同培养体系中的细胞进行反复传代培养后,发现SSC可持续存在并可经常观察到成对出现的圆形细胞,显示SSC在体外持续培养至少可维持生存3个月以上。

这种成对出现的细胞分析可能为SSC的对称性分裂形成两个SSC或不对称性分裂,形成1个SSC和1个将进入分化途径的定向细胞。

在长期培养过程中,贴附于Sert oli细胞表面的球形或卵圆形SSC数量呈现逐渐减少的趋势。

前期我们对人SSC移植于裸鼠的研究已经证实该移植技术可作为人SSC分离、分选、培养后的有效功能鉴定方法。

本研究进一步应用该技术对上述培养后细胞中SSC的存在进行了功能鉴定,以了解SSC在培养条件下的长期生存和扩增情况,结果证实成人睾丸分选后生殖细胞在培养2周和4周后仍分别保留54.9%和9.2%的干细胞。

而胎儿生殖细胞在培养2周和4周后仍分别保留62.3%和14.7%的干细胞。

这一结果显著高于有关文献利用小鼠生殖系干细胞体外培养后的功能鉴定结果[14]。

可见在本培养体系中,成人和胎儿SSC在体外均可较长期的维持生存。

同时随着培养时间的延长,干细胞呈逐渐减少趋势,这与显微镜下观察到的圆球形细胞数量逐渐减少的现象相吻合。

原因可能为:①SSC 是分裂活性较低的原始细胞,在与胎儿Sert oli细胞共同培养中,SSC扩增缓慢或仅维持存活,因而呈现其比例逐渐降低;②SSC在培养中发生了分化,形成精母细胞及精子细胞;③培养条件不能完全满足SSC的良好生存,故逐渐发生凋亡而减少。

在培养中我们发现胎儿生殖细胞较成人细胞能够更好、更稳定地在体外维持扩增或生存,移植研究亦显示培养2周和4周后,保留的干细胞比例略高于成人。

(下转894页)
NA和蛋白质表达外,局部特异性因素也具有一定的调节作用。

在睾丸和前列腺内,糖尿病对AR表达的影响发生在翻译和/或翻译后水平;在附睾内,糖尿病对AR表达的影响发生在转录水平。

同时也说明AR的mRNA及蛋白表达并不同步,AR在基因和蛋白水平表达的调节因素并不完全一致,进一步突出了局部特异性因素对AR表达调节的重要性。

在mRNA及蛋白质水平,D和I D组AR在附睾及睾丸、前列腺内表达水平下降,可能是低T水平和局部特异性因素综合作用的结果。

糖尿病在引起大鼠血清T水平下降的基础上,还在睾丸、附睾和前列腺等不同部位,于mRNA及蛋白质水平上降低了AR的表达,从而削弱了AR对雄激素的转录调节作用,使雄激素的生物利用度降低,对性与生殖功能的调节和维持作用减弱,可能是引起性与生殖功能障碍的原因之一。

糖尿病引起AR 表达异常的原因可能有两个方面:一方面,睾丸间质细胞结构和功能受损,使T的生成减少而使T水平低下,减弱了对AR表达的调节作用;另一方面,糖尿病所致蛋白质代谢紊乱影响了AR的正常合成、代谢及生物学功能。

参考文献
[1]　Lower K M,Kumar R,Woollatt E,et al.Partial andr ogen insen2
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(徐建平　编发)
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对SSC体外稳定培养体系进一步优化将有可能在体外产生大量SSC,为深入了解SSC生物学特性和男性生精功能障碍治疗开辟广阔的前景。

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(夏欣一　编发)。