国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定

国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定

1 范围

本标准规定了国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定的生物安全要求，鉴定程序，鉴定方法，结果报告等内容。

本标准适用于国境口岸入出境人员感染结核分枝杆菌复合群的检测鉴定。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489 实验室生物安全通用要求

结核病实验室生物安全手册世界卫生组织

人间传染的病原微生物名录卫生部

3 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis）：聚丙烯酰胺凝胶电泳

TBE （Tris-Boric acid）：Tris-硼酸核酸电泳缓冲液

bp（base pair）：碱基对

4 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

4.1

结核分枝杆菌复合群Mycobacterium Tuberculosis Complex；MTC

传染性结核病的病原菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌。MTC的细菌呈杆状，菌体大小0.6 μm×(1 μm～4 μm)，抗酸染色阳性，革兰氏染色阳性。生长缓慢，约10 h繁殖一代，据接种量的多少，10 d～30 d肉眼可见菌落生长。罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上的菌落粗糙、致密，呈颗粒、结节、或菜花样，乳白或米色，不透明。

5 生物安全措施

根据WHO《结核病实验室生物安全手册》与GB 19489和《人间传染的病原微生物名录》的要求，结核分枝杆菌复合群相关检测鉴定材料的生物安全要求如下：

——样本处理与检测应于生物安全二级（BSL-2）实验室，在IIA级或以上级别生物安全柜内进行；

——大量活菌操作，如培养物鉴定，药敏检测等，应在生物安全三级（BSL-3）实验室或结核病防护实验室内的生物安全柜中进行。结核病防护实验室，是指在生物安全二级实验室基础上，实验区域与实验室外部由缓冲区域物理隔离，实验区域控制为单向气流；

——MTC的细菌培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814；

——操作人员佩戴医用N95口罩，穿着一次性防护服，戴一次性医用橡胶手套，更换防水工作鞋；

——操作人员需要每年进行胸部X光检查、血清HIV检查。

6 仪器和设备

II级生物安全柜

电子天平

水平冷冻离心机（离心力3 500 g以上）

37℃恒温培养箱

荧光PCR仪

水平电泳仪

紫外成像仪

100℃热浴仪

正置光学显微镜

微量加样器（2 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL）

7 试剂和耗材

PCR反应体系（商品化试剂）

0.067 mmol/L，pH6.8磷酸缓冲液（PBS）

N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）

无菌4%NaOH溶液

无菌2.9%枸橼酸钠溶液

苯酚

无水乙醇

罗氏培养基

革兰氏染色液

抗酸染色液

TBE电泳缓冲液

DNA分子量标准（DNA Ladder Marker）

50 mL无菌离心管

8 实验室检查

8.1生长周期检查

8.1.1 罗氏培养基上MTC的生长周期

痰标本中的MTC在罗氏培养基上生长，通常第3周以后开始出现肉眼可见的菌落。

8.1.2 7H9液体培养基中MTC的生长周期

8.1.2.1 痰标本中的MTC在7H9液体培养基中生长，通常第14 d左右出现显微镜下可见的菌落。

8.1.2.2 痰标本中的MTC数量多、繁殖旺盛时，接种后第4 d左右出现显微镜下可见的菌落。通常液体培养样本接种后立即报告阳性的为其他污染细菌。

8.2形态学检查

肉眼观察罗氏培养基上的菌落。MTC在罗氏培养基上是乳白或米色、不透明、粗糙、致密，呈颗粒、结节、或菜花样的菌落，单个菌落散在或聚集，参见附录A图A.1和图A.2，也可见细小的菌落连成一片菌苔。

8.3抗酸染色检查

8.3.1 痰涂片的抗酸染色及检查

痰涂片抗酸染色后在1 000倍放大的正置光学显微镜下MTC呈红色的细长杆菌。部分红色菌体中可见浓染颗粒。可以一条散在，也可多条聚集，也可成团或成簇。参见附录A图A.3和图A.4。

8.3.2 罗氏培养基上MTC的抗酸染色及检查

罗氏培养基上的MTC菌落涂片抗酸染色后，在1 000倍放大的正置光学显微镜下呈成片的红色杆菌，密集成团。参见附录A图A.5。

8.3.3 液体培养基7H9中MTC的抗酸染色及检查

液体培养基中的MTC涂片抗酸染色后，在1 000倍放大的正置光学显微镜下呈致密、条索状的红色菌团。参见附录A图A.6。

8.4免疫学鉴定方法

通过对液体培养基中MPB64分泌蛋白的检测，能够确定培养基中是否含有结核分枝杆菌复合群。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，按照说明书进行检测。

8.5 分子生物学鉴定方法

8.5.1 MTC的实时荧光PCR检查

通过对痰液样本或培养物中结核分枝杆菌特异性核酸片段的检测，鉴定样本中是否含有结核分枝杆菌复合群。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，按照说明书进行检测。

8.5.2 MTC的线性探针杂交固相膜显色检测

通过扩增结核分枝杆菌16S rRNA特异性片断，扩增产物经过化学变性后，与带有探针固化的试纸条杂交，通过显色反应检测确定是否含有目的片段。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，如：Hain Lifescience公司的Geno Type(r) MTBDRplus 1），按照说明书进行检测。

8.5.3 MTC的DNA序列测定及比对

参见附录B。

8.5.4 MTC核酸及rpoB基因突变检测

检测结核菌阳(涂片阳性或者细菌培养阳性)痰沉淀物样本中的结核分枝杆菌复合群特异性核酸片段和利福平耐药相关的rpoB基因突变，完成分枝杆菌鉴定及利福平耐药分析。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，如：Cepheid公司的Xpert MTB/RIF 2），按照说明书进行检测。

9 MTC的鉴定及报告

9.1 痰液标本中MTC的鉴定和报告