结核分枝杆菌复合群四重PCR检测方法的建立及应用

结 核 分 枝 杆 菌 （ Ｏ ～ｕ ｅｃ ｌｓｓ Ｍｙ ｏ ａ ｔｒ ｍ ， Ｄ ｌｔ ｂ ｒｕｏ ｉ ｌ ｃ ｂ ｃｅｉ ｕ
Ｎ ） 导 致 与 结 核 病 类 似 的症 状 ， ＴＢ 常 常规 的 临 床诊 断技术 如 Ｘ光 透视 、 痰菌 涂 片 等很 难 区分口 。在人 结 核 预 防 上 ， 展 中 国 家 普 遍 采 取 儿 童 卡 介 苗 发 （ Ｃ 接种 。Ｂ Ｇ是 一 种 牛 分 枝 杆 菌 （ ｃｂ ｃ — Ｂ Ｇ） Ｃ Ｍｙ ｏａ ｔ ｅ ｒｕ ｏ ｉ ，Ｍ． ｏ ｉ） 弱 菌株 ， ｉｍ ｂ ｒｓ ｂ ｖｓ致 对免 疫 缺陷 人 具有
定 毒 力＿ 。由于结 核分枝 杆 菌 、 ２ ］ 牛分枝 杆 菌 、 非结
作 者 单 位 ：． 中农 业 大 学 农 业 微 生 物 学 国 家 重 点 实 验 室 ， 汉 １华 武
４ ０ ７ ３ ０ ０；
核 分枝杆 菌的致 病 性和对 抗结 核 治疗 药物 的敏 感性
２ 华 中 农 业 大 学 动 物 科技 动 物 医 学 院 ， 汉 ４ ０ ７ ； ． 武 ３ ０ ０ ３ 武 汉 市结 核 病 防 治研 究所 ， 汉 ４ ０ ３ ． 武 ３００
非 结 核 分 枝 杆 菌 （ ２ ｐ １ 带 ） 卡 介 苗 （ ２ ｐ和 ６ １ｂ ８ ４ｂ 条 、 ８ ４ｂ ２ ｐ２条 带） 牛分 枝 杆 菌 （ ２ ｐ ６ １ｂ 、 ８ ４ｂ 、 ２ ｐ和 ２ ４ｂ ５ ｐ３条 带） 结 核 分 枝 和
杆菌（ ４条 带 ） 检 测 灵 敏 度 达 到 １５ｇ 。 ２ ｆ。对 ４ ２份 牛 结 核 菌 素 皮 内变 态 反 应 阳性 牛 的肺 淋 巴结 样 本 和 １５份 肺 结 核 病 人 的 痰 １
Ｐ Ｒ 需 要 多 次 反 应 才 能 完 成 分 型 鉴 定 全 过 程 ， 仅 Ｃ 不 耗 时 耗 力 ， 时 也 增 加 了不 确 定 性 。 同
Fra Baidu bibliotek
的引物组 合 。
１４ 不 同样 品 的 处 理 及 Ｄ ． ＮＡ 抽 提 １ ４ １ 细 菌 处 理 经 纯 化 培 养 的 结 核 分 枝 杆 菌 、 ． ．
菌 复 合 群 ４个 特 异 性 基 因 １ ｓ ＮＡ、Ｓ １ ０ ＲＶ ６ ２ Ｒ ８ ３设 计 引 物 ， 过 筛 选 优 化 引 物 浓 度 、 火 温 度 、 浓 度 和 ６Ｒ Ｉ ６ １ 、 ２ ５ 、 Ｖ３ ７ 通 退 Ｍｇ
ｄ Ｐ 浓度 ， 定 了最 佳 反 应 条 件 。结 果 扩 增 产 物 的大 小 分 别 为 ８ ４ｂ 、２ ｐ ４ ８ｂ ＮＴ 确 ２ ｐ ６ １ｂ 、１ ｐ和 ２ ４ｂ ， 特 异 性检 测 并 鉴 别 出 ５ ｐ 能
结核 病是 一种 古老 的 、 性 消耗 性 人 兽 共 患 传 慢 染 病 。 人 结 核 主 要 由 结 核 分 枝 杆 菌
（ ｙ ｏ ａｔｒｕ ｕ ｅｃ ｌｓｓ Ｍ ｃｂ ｃｅｉｍ ｔｂｒｕｏｉ ，Ｍ ＴＢ 引 起 ， 在 发 ） 但 展 中 国家 ， １ 的 人 结 核 是 由 牛 结 核 引 起 的 。 非 约 Ｏ
中 国 人 兽 共 患 病 学 报
２ ２， ２ （ ０１ ８ ４）
Ｃｈｉ ｅ ｅ Ｊ ｒ ｌｏｆ Ｚｏ ｏｓ ｓ ｎ ｓ ｏｕ ｎａ ｏｎ ｅ
３ ３ ３
文 章 编 号 ：０ ２ ６４ ２ １ ）４ ３ ３ ５ １ ０ —２ ９ （ ０ ２ ０ —０ ３ —０
结核 分枝杆 菌复合群 四重 Ｐ Ｒ检 测 方法 的 建 立 及 应 用 Ｃ ＊
液 样 品进 行 了检 测 ， 检 出 率 或 准 确 率 明 显 高 于 传 统 方 法 。 结 论 成 功 建 立 了 多 重 Ｐ Ｒ 方 法 ， 快 速 、 确 地 对 结 核 分 枝 杆 其 Ｃ 能 准
菌群进行种 、 鉴别。 型
关键词 ： 核 ； 核分枝杆 菌； 结 结 牛分 枝 杆 菌 ； 多重 Ｐ Ｒ； 别诊 断 Ｃ 鉴 中 图 分 类 号 ： ３ ８９ 文 献 标 识 码 ： Ｒ ７ １ Ａ
不 尽相 同 ， 临床治 疗 前 进 行 病 原 菌 的鉴 别 诊 断显 在
得尤 为重 要 Ｌ 。 目前普 遍采 用 的方法 是 依靠 生化 手 ３ ］
３４ ３
中 国 人 兽 共 患 病 学 报
段进行 型 别鉴 定 ， 方法 存 在 耗 时 长 、 作 复杂 、 该 操 主
观性 强 等 缺 点 。而 以基 因 分 型 鉴 定 为 基 础 的 常 规
ＡＢＳ ＲＡ Ｔ ＣＴ： ｉ ｓ ｕ ｙ ｗａ ｉ ｄ ｔ ｓ ａ ｌ ｈ ａｍｕ ｔ ｌｘ ＰＣＲ ａ ｓ ｙ ｔ ａ ｉ ｌ ｅ ｔｆ ｐ ｃｆｃｔ ｐ ｆＭｙｃ ｂ ｃｅ ｉ ｍ ｕ Ｔｈ ｓ ｔ ｄ ｓａｍｅ ｏ ｅ ｔ ｂ ｉ ｌｉ ｅ ｓ ｐ ｓ ａ ｏ ｒ ｐ ｄ ｙ ｉ ｎ ｉ ｓ ｅ ｉ ｙ ｅｏ ｄ ｙ ｉ ｏ ａ ｔｒｕ ｔ
程 实 ， 陈 伟 ， 颖 钰 ， 军。 苗 北 平 。 郭 爱 珍 陈 。陈 ， ， 。
摘 要 ： 目的 本 文 旨在 建 立 一种 能 快 速 鉴 定 结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群 不 同成 员 的 多 重 Ｐ Ｒ 方 法 。方 法 针 对 结 核 分 枝 杆 Ｃ
一
＊艾 滋 病 和 病 毒 性 肝 炎 等 重 大 传 染 病 防 治 科 技 重 大 专 项
（ ０ ８ ２ ０ ＺＸ１ ３ ，２ ０ Ｚ ０ ０１ ０ ９ Ｘ１ ０ ４ ｌ ０ ０ 一 ０７，２ Ｏ ＺＸ１ ６ ２ ｌ ） ０ ９ ０ ０ 一 ４
通 讯 作 者 ： 爱珍 ； ｍａｌａｚ ｅ ＠ ｍａｌｈ ａ ． ｄ ． ｎ 郭 Ｅ ｉ ｉ ｎ ： ｈ ｉ ｚｕ ｅｕ ｃ ．
Ｅｓ ａ ｌｓ ｍ ｅ ｎ ｐｐ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｕ ｔｐ ｅ ｔ ｂ ｉｈ ｎｔａ ｄ ａ ｌｃ ｔｏ ｆｍ ｌ ｉ ｌ ｘ ＰＣＲ ｏ ｄ ｔ ｃ ｔ ｅｅ ｔ ａ ｉ ｆ ｒ ｎｔａ ｅ Ｍ ｙ ｏ ａ ｔ ｒ ｕｍ ｕ ｅ ｃ ｌ ｓ ｓ ｎｄ ｄ ｆ ｅ ｅ ｉ ｔ ｃ ｂ ｃｅ ｉ ｔ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ
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ＣＨＥＮＧ ｈ ， Ｓ ｉ ＣＨＥＮ ｅ ， Ｗ ｉ ＣＨ ＥＮ ｒｉ ｇ ｙ ＣＨ ＥＮ ｎ， Ｉ ｎ — ｕ， Ｊ ｕ Ｍ ＡＯ ｉ ｉ ｇ ＧＵ Ｏ Ａｉ ｈ ｎ Ｂｅ— ｎ ， ｐ — ｅ ｚ
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牛分枝 杆菌 、 卡介 苗 、 鸟分枝 杆菌 、 内分枝 杆 菌 、 胞 耻 垢 分枝 杆 菌 、金黄 色葡 萄球菌 、 乳链 球 菌 、 无 鼠伤寒
多重 Ｐ Ｒ技 术是在 同一 Ｐ Ｒ反应体 系 中含有 Ｃ Ｃ 多对 特异 性引物 、 时特 异性 针对 不 同靶 区 域进 行 同
ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ｏ ｐ ｅ ． Ｔ ｈｅｐｒｍ ｅ ｓ ｓ ｅ ｉｉ ｏ ｆ ｅ ｓ １ ｓ ｒ ＮＡ ，Ｉ １１ ｅ ｃ ｌ ｓｓ ｃ ｍ ｌ ｘ ｉ ｒ ｐ ｃｆｃｔ ｏｕｒｇ ｎｅ ６ Ｒ Ｓ６ ０，ＲＶ ２ ２ ａ Ｖ３８７ ｎ ｅ ｍ ｅ ｆＭ ｙｃ ｂ ｔ ｒ ｕｍ ６５ ｎｄ Ｒ ３ ｉ ｇ ｎｏ ｓ ｏ ｏ ａｃｅ ｉ ｔ ｂｅ ｃ ｏ ｉ ｏ ｐｌｘ ｅ ｂｅ ｓ ｗ ｅ ｅ ｄｅ ｉ ｕ ｒ ｕｌ ｓｓｃ ｍ ｅ ｍ ｍ ｒ ｒ ｓｇｎｅ ． Ｔｈｅ ｐｒｍ ｅ ｓ ａ ｄ ｔ ｉ ｏｎ ｅ ｒ ｔｏｎ ｄ ｉ ｒ ｎ ｈｅｒ ｃ ｃ ｎｔ ａ ｉ ｓ，ａ ｎｎｅ ｌｎ ｅ ｐｅ ａ ｕｒ ｎｄ ｔ ｏ ｅ ｔ ａ ａｉ ｇ ｔ ｍ ｒ ｔ ｅ ａ ｈｅ ｃ ｎｃ ｎ ｒ