结核分枝杆菌耐药分子机制及耐药基因检测方法研究进展
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[ 中图分类号 ] R378191 + 1 ,R44615 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 1008 - 1372 ( 2002) 04 - 0338 - 05
近年来 ,在全球范围内 ,结核分枝杆菌耐药率不断 上升 ,高耐药和多耐药菌株不断出现和传播 ,对化疗疗 效及结核病流行产生很大影响 , 药物敏感性检测更显 重要 。 在临床实验室 , 目前分枝杆菌药物敏感性检测仍 采用常规方法 ,即绝对浓度法 , 比例法和抗性比率法 。 但这些方法均以细菌生长为终点判断结果 , 由于结核 分枝杆菌生长缓慢 ,在得到分离培养物后仍需 1～2 个 月方能获得结果 ,急需建立快速 、 准确 、 可靠的药物敏 感性试验方法 。近年来 , 随着分子生物学理论和技术 的发展 ,结核分枝杆菌的耐药机制及耐药的分子基础 大部分已被阐明 ,建立了快速检测结核分枝杆菌耐药 基因的方法 ,为结核分枝杆菌快速药物敏感性试验开 辟了一条新的途径 。
中国医师杂志 2002 年 4 月 第 4 卷第 4 期
339 pncA 基因含 561 个核苷酸 , 结核分枝杆菌耐 PZA
扰原核生物蛋白质合成的氨基糖苷类抗生素 。其主要 作用部位在核糖体 30S 亚基 ( 由 21 种核糖体蛋白和 16S rRNA 组成) ,引起遗传密码的错读 , 翻译启动的抑 制及校对的异常 , 从而抑制蛋白质合成 , 发挥抗菌作 用。 从基因水平的研究已发现结核分枝杆菌对 SM 耐 药性与编码核糖体 30S 亚基 S12 蛋白的 rpsL 基因和编 码 16SrRNA 的 rrs 基因突变有关 ,80 %耐 SM 结核分枝 杆菌临床分离株可见 rpsL 或 rrs 突变 。rpsL 基因最常 见的是 43 位密码子 AAG (Lys) AGG ( Arg) 的突变 ,88 位密码子也可发生同样突变 。少数可见 43 位 Lys Thr 的转变 。rrs 基因突变主要集中于相当于大肠杆菌 的 530 环区和 915 区 ,可见核苷酸 491 位 C T ,512 位 C T ,513 位 A C 或 A T ,516 位 C T ,903 位 C G 或 C A ,904 位 A G 的突变 ( 分别相当于大肠杆菌
免疫学 、 分子生物学研究工作 。 曾参加军队 “八五” 攻关课题 、 国 家卫生部医学科学基金重点课 题等 10 余项研究课题 ,现参加国 家 973 规划 “严重传染病防治基 础研究” 项目中子课题研究 。曾 获国家级科学技术进步三等奖 1 项 ; 军队级 、 国家卫生部和北京 市科学技术进步二等奖 5 项 、 三 等奖 6 项 。参加专 ( 译 ) 著编写 4 本 ,发表论文共 50 余篇 。
http://www.cnki.net
关于 INH 作用机制 , 目前的
研究认为 : INH 进入菌体后 ,在分枝杆菌过氧化氢酶 过氧化物酶作用下氧化脱氢生成亲电子形式 。这种过 氧化氢酶 - 过氧化物酶活化的 INH 形式能与分枝杆
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
聚合酶β 亚基结合 , 抑制 RNA 聚合酶活性 , 干扰分枝 杆菌 RNA 的转录及合成 ,阻碍蛋白质合成而发挥抗菌 作用 。近年来的研究发现结核分枝杆菌耐 RFP 的发 生是由于其编码 RNA 聚合酶β 亚基的 rpoB 基因突变 所致 。rpoB 基因含有 3534bp 的开放阅读框架 , 编码
1178 个氨基酸 。rpoB 基因少数密码子突变引起它所
编码的氨基酸改变 ,使 RNA 聚合酶分子原有 RFP 结合 点的构象发生改变 , 失去结合 RFP 的能力 , 而导致耐 RFP 。 在结核分枝杆菌耐 RFP 分离株中 ,约 95 %～98 % 检出 rpoB 基因突变 ,突变一般发生在一个高度保守的 81bp ( 507～533 位 27 个氨基酸密码子 ) 组成的区域内 。 最常见的突变位点是 531 位丝氨酸 ( Ser ) 亮氨酸
(Leu) 置换 ,526 位组氨酸 ( His) 酪氨酸 ( Tyr) 、 天门冬 ( ) ( ) 氨酸 Asp 或半胱氨酸 Cys 置换 ,516 位 Asp 缬氨酸 (Val ) 置换 。 1・ 2 异烟肼 ( INH)
[5～8 ]
药。 Kat G 基因位于结核分枝杆菌染色体上 ,含 2223 个 核苷酸 , 在耐 INH 结核分枝杆菌分离菌株中 , 约 10 ～ 24 %分离株发生 Kat G 完全缺失 ,过氧化氢酶 - 过氧化 物酶阴性 ,高度耐 INH ,50 %～70 %出现点突变部份缺 失或插入 。是常见的点突变是 315 位 Ser ( AGC) - Thr (ACC) 、 天冬酰胺 ( Asn) ( AAC) 、 ILe ( ATC) 或 Arg ( CGC) 置换 ,315 位 Ser 是决定酶活性的关键部位 。还可见 Kat G 基因 104 位 Arg 、 108 位 His 、 138 位 Asn 、 148Leu 、 270 位 His 、 275 位 Thr 、 312 位 Trp 和 381 位 Asp 密码子 突变 。inhA 基因突变主要见于 94 位 Ser Ala 置换 。 1・ 3 链霉素 ( SM) [5 ,9 ,10 ] SM 是一种在核糖体水平干
338
Journal of Chinese Physician , April ,2002 , Vol 4 , No4
・ 专家论述・
结核分枝杆菌耐药分子机制及耐药基因检测方法研究进展
解放军 309 医院全军结核病中心研究室 ( 北京 100091) 李国利 关键词 结核分枝杆菌 ; 耐药基因 ; 检测 ; 综述
1 结核分枝杆菌的耐药分子机制 1・ 1 利福平 ( RFP) [1～5 ] RFP 是通过特异地与 RNA
பைடு நூலகம்
菌分枝菌酸生化合成途 径中的烯酰基还原酶 NADH 复 合 体 结 合 , 抑 制其活性 , 干扰分枝菌 酸合成 , 发挥抗菌的作 用 。结 核 分 枝 杆 菌 耐 INH 与过氧化氢酶 - 过 氧化 物 酶 编 码 基 因 Kat G 和/ 或烯酰基还原 酶编码基因 inhA 突变 李国利 有 关 。 Kat G 基 因 的 突 解放军第 309 医院全军结核 变导致过氧化氢酶 - 过 病中心研究室副主任技师 , 中国 氧化物酶活性降低或丧 防痨协会基础 ( 含细菌 ) 专业委 失 ,阻止 INH 转换成活 员会委员 。从事结核病细菌学 、 性形式 , 导致耐药 。活 化 INH 形 式 抑 制 烯 酰 基还原酶活性作用好像 取决于结合烯酰基还原 酶活 性 部 位 的 NADH , 编码 烯 酰 基 还 原 酶 的 inhA 基因 94 位密码子 突变使 NADH 与之结合 降低 , 抑制了 INH 活化 形式的结合率 , 产生耐
近年来 ,在全球范围内 ,结核分枝杆菌耐药率不断 上升 ,高耐药和多耐药菌株不断出现和传播 ,对化疗疗 效及结核病流行产生很大影响 , 药物敏感性检测更显 重要 。 在临床实验室 , 目前分枝杆菌药物敏感性检测仍 采用常规方法 ,即绝对浓度法 , 比例法和抗性比率法 。 但这些方法均以细菌生长为终点判断结果 , 由于结核 分枝杆菌生长缓慢 ,在得到分离培养物后仍需 1～2 个 月方能获得结果 ,急需建立快速 、 准确 、 可靠的药物敏 感性试验方法 。近年来 , 随着分子生物学理论和技术 的发展 ,结核分枝杆菌的耐药机制及耐药的分子基础 大部分已被阐明 ,建立了快速检测结核分枝杆菌耐药 基因的方法 ,为结核分枝杆菌快速药物敏感性试验开 辟了一条新的途径 。
中国医师杂志 2002 年 4 月 第 4 卷第 4 期
339 pncA 基因含 561 个核苷酸 , 结核分枝杆菌耐 PZA
扰原核生物蛋白质合成的氨基糖苷类抗生素 。其主要 作用部位在核糖体 30S 亚基 ( 由 21 种核糖体蛋白和 16S rRNA 组成) ,引起遗传密码的错读 , 翻译启动的抑 制及校对的异常 , 从而抑制蛋白质合成 , 发挥抗菌作 用。 从基因水平的研究已发现结核分枝杆菌对 SM 耐 药性与编码核糖体 30S 亚基 S12 蛋白的 rpsL 基因和编 码 16SrRNA 的 rrs 基因突变有关 ,80 %耐 SM 结核分枝 杆菌临床分离株可见 rpsL 或 rrs 突变 。rpsL 基因最常 见的是 43 位密码子 AAG (Lys) AGG ( Arg) 的突变 ,88 位密码子也可发生同样突变 。少数可见 43 位 Lys Thr 的转变 。rrs 基因突变主要集中于相当于大肠杆菌 的 530 环区和 915 区 ,可见核苷酸 491 位 C T ,512 位 C T ,513 位 A C 或 A T ,516 位 C T ,903 位 C G 或 C A ,904 位 A G 的突变 ( 分别相当于大肠杆菌
免疫学 、 分子生物学研究工作 。 曾参加军队 “八五” 攻关课题 、 国 家卫生部医学科学基金重点课 题等 10 余项研究课题 ,现参加国 家 973 规划 “严重传染病防治基 础研究” 项目中子课题研究 。曾 获国家级科学技术进步三等奖 1 项 ; 军队级 、 国家卫生部和北京 市科学技术进步二等奖 5 项 、 三 等奖 6 项 。参加专 ( 译 ) 著编写 4 本 ,发表论文共 50 余篇 。
http://www.cnki.net
关于 INH 作用机制 , 目前的
研究认为 : INH 进入菌体后 ,在分枝杆菌过氧化氢酶 过氧化物酶作用下氧化脱氢生成亲电子形式 。这种过 氧化氢酶 - 过氧化物酶活化的 INH 形式能与分枝杆
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
聚合酶β 亚基结合 , 抑制 RNA 聚合酶活性 , 干扰分枝 杆菌 RNA 的转录及合成 ,阻碍蛋白质合成而发挥抗菌 作用 。近年来的研究发现结核分枝杆菌耐 RFP 的发 生是由于其编码 RNA 聚合酶β 亚基的 rpoB 基因突变 所致 。rpoB 基因含有 3534bp 的开放阅读框架 , 编码
1178 个氨基酸 。rpoB 基因少数密码子突变引起它所
编码的氨基酸改变 ,使 RNA 聚合酶分子原有 RFP 结合 点的构象发生改变 , 失去结合 RFP 的能力 , 而导致耐 RFP 。 在结核分枝杆菌耐 RFP 分离株中 ,约 95 %～98 % 检出 rpoB 基因突变 ,突变一般发生在一个高度保守的 81bp ( 507～533 位 27 个氨基酸密码子 ) 组成的区域内 。 最常见的突变位点是 531 位丝氨酸 ( Ser ) 亮氨酸
(Leu) 置换 ,526 位组氨酸 ( His) 酪氨酸 ( Tyr) 、 天门冬 ( ) ( ) 氨酸 Asp 或半胱氨酸 Cys 置换 ,516 位 Asp 缬氨酸 (Val ) 置换 。 1・ 2 异烟肼 ( INH)
[5～8 ]
药。 Kat G 基因位于结核分枝杆菌染色体上 ,含 2223 个 核苷酸 , 在耐 INH 结核分枝杆菌分离菌株中 , 约 10 ～ 24 %分离株发生 Kat G 完全缺失 ,过氧化氢酶 - 过氧化 物酶阴性 ,高度耐 INH ,50 %～70 %出现点突变部份缺 失或插入 。是常见的点突变是 315 位 Ser ( AGC) - Thr (ACC) 、 天冬酰胺 ( Asn) ( AAC) 、 ILe ( ATC) 或 Arg ( CGC) 置换 ,315 位 Ser 是决定酶活性的关键部位 。还可见 Kat G 基因 104 位 Arg 、 108 位 His 、 138 位 Asn 、 148Leu 、 270 位 His 、 275 位 Thr 、 312 位 Trp 和 381 位 Asp 密码子 突变 。inhA 基因突变主要见于 94 位 Ser Ala 置换 。 1・ 3 链霉素 ( SM) [5 ,9 ,10 ] SM 是一种在核糖体水平干
338
Journal of Chinese Physician , April ,2002 , Vol 4 , No4
・ 专家论述・
结核分枝杆菌耐药分子机制及耐药基因检测方法研究进展
解放军 309 医院全军结核病中心研究室 ( 北京 100091) 李国利 关键词 结核分枝杆菌 ; 耐药基因 ; 检测 ; 综述
1 结核分枝杆菌的耐药分子机制 1・ 1 利福平 ( RFP) [1～5 ] RFP 是通过特异地与 RNA
பைடு நூலகம்
菌分枝菌酸生化合成途 径中的烯酰基还原酶 NADH 复 合 体 结 合 , 抑 制其活性 , 干扰分枝菌 酸合成 , 发挥抗菌的作 用 。结 核 分 枝 杆 菌 耐 INH 与过氧化氢酶 - 过 氧化 物 酶 编 码 基 因 Kat G 和/ 或烯酰基还原 酶编码基因 inhA 突变 李国利 有 关 。 Kat G 基 因 的 突 解放军第 309 医院全军结核 变导致过氧化氢酶 - 过 病中心研究室副主任技师 , 中国 氧化物酶活性降低或丧 防痨协会基础 ( 含细菌 ) 专业委 失 ,阻止 INH 转换成活 员会委员 。从事结核病细菌学 、 性形式 , 导致耐药 。活 化 INH 形 式 抑 制 烯 酰 基还原酶活性作用好像 取决于结合烯酰基还原 酶活 性 部 位 的 NADH , 编码 烯 酰 基 还 原 酶 的 inhA 基因 94 位密码子 突变使 NADH 与之结合 降低 , 抑制了 INH 活化 形式的结合率 , 产生耐