膜蛋白[membrane protein]的分离
细胞膜蛋白的提取
细胞膜蛋白的提取1. 引言细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质，它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。
细胞膜蛋白具有多种功能，包括细胞识别、信号转导、运输和通道形成等。
为了研究细胞膜蛋白的结构和功能，科学家需要从细胞中提取这些蛋白质。
本文将介绍细胞膜蛋白的提取方法和步骤。
2. 细胞膜蛋白的提取方法2.1 细胞膜蛋白的提取原理细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质，与细胞膜紧密结合。
因此，提取细胞膜蛋白需要破坏细胞膜，并保持蛋白质的完整性。
常用的细胞膜蛋白提取方法包括机械破碎法、化学溶解法和超声波法等。
2.2 机械破碎法机械破碎法是一种常用的细胞膜蛋白提取方法。
其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。
2.破碎细胞：将细胞悬浮液置于低温条件下，加入适量的缓冲液，然后用高速搅拌器或超声波破碎仪破碎细胞，使细胞膜破裂。
3.离心：将破碎后的细胞悬浮液进行离心，分离出上清液和沉淀。
4.收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，这个上清液中含有细胞膜蛋白。
2.3 化学溶解法化学溶解法是另一种常用的细胞膜蛋白提取方法。
其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。
2.加入溶解剂：向细胞悬浮液中加入适量的溶解剂，如磷酸盐缓冲液或甘油，使细胞膜破裂。
3.搅拌：将细胞悬浮液与溶解剂充分混合，并用搅拌器搅拌一定时间，使细胞膜蛋白溶解在溶液中。
4.离心：将溶解后的细胞悬浮液进行离心，分离出上清液和沉淀。
5.收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，这个上清液中含有细胞膜蛋白。
2.4 超声波法超声波法是一种快速、高效的细胞膜蛋白提取方法。
其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。
2.加入超声波溶解剂：向细胞悬浮液中加入适量的超声波溶解剂，如磷酸盐缓冲液，使细胞膜破裂。
3.超声波处理：将细胞悬浮液置于超声波处理器中，进行超声波处理，使细胞膜破裂。
膜蛋白结构生物学
第2章膜蛋白结构生物学研究膜蛋白是一类具有非常重要功能的蛋白，根据其在膜上的定位可以分为外周膜蛋白（镶嵌在膜表面）、穿膜蛋白（其膜外部分仅在膜的一边）和跨膜蛋白（膜的两边都有膜外部分），根据膜蛋白的穿膜方式分为单次跨膜蛋白和多次跨膜蛋白。
膜蛋白具有一个定位在细胞膜上的疏水区域，膜蛋白在没有去污剂存在的情况下是不溶于水的，因此在对膜蛋白进行体外研究时，我们经常需要选用一定的去污剂来融解膜蛋白；膜蛋白的提取、纯化和结晶与水溶性蛋白是有一定区别的。
下面列出了膜蛋白和膜蛋白研究的一些特点：z有大约百分之三十的基因是编码膜蛋白的z膜蛋白的种类繁多，如离子通道，受体，离子泵，转运蛋白等z膜蛋白在组织，细胞中的丰度比较低z膜蛋白极其疏水的特性使其纯化变得很困难z利用基因工程技术表达膜蛋白要比表达水溶性蛋白难很多z膜蛋白的纯化和结晶相对水溶性蛋白要难z膜蛋白晶体衍射比较弱，分辨率比较低膜蛋白结构生物学由于膜蛋白样品难于制备而远远落后于可溶性蛋白结构生物学的发展，1960年，第一个可溶性蛋白质（肌血球蛋白）的晶体结构得到解析[5]，并存入蛋白质结构数据库（PDB）中，此后PDB库中可溶性蛋白质的三维晶体结构数据不断增加，而关于膜蛋白的晶体结构记录为零。
人们曾经一度认为，膜蛋白是不可能得到晶体的。
直到1982年，这个错误的认识才被纠正过来，德国科学家H.Michel长出了世界上第一个膜蛋白晶体——紫细菌光反应中心（如图2.1），之后在三位德国科学家J.Deisenhofer, R.Huber和H.Michel 的共同努力下，他们于1985年公布了世界上第一个膜蛋白的三维精细晶体结构。
这是一个非常重大的成就，宣布了蛋白质晶体学向膜蛋白的进军，预示着许多重要的膜蛋白结构能够被解析。
因此，J.Deisenhofer, R.Huber和H.Michel三个人分享了1988年的Nobel化学奖。
2526J.Deisenhofer, H.Michel Science (245):1463,1989J.Dersenhofer, O.Epp, K.Miki, R.Huber, H.Michel, Nature (318):618,1985 J.Deisenhofer, O.Epp, K.Miki, R.Huber, H.Michel, J.Mol.Biol.(180):385,1984 H.Michel J.Mol.Biol.(158):567,1982First Membrane Protein Structure:Photosynthetic Reaction Center of Rhodopseudomonas virdis Complex (four subunits)solved in 1985 (1PRC)Nobel Chemistry Prize was awarded to J.Deisenhofer, R.Huber, H.Michel in 1988. 图2.1 世界上第一个膜蛋白的三维结构图 Till July 23rd, 2005, there are membrane protein structures deposited inPDB and total membrane protein structures in PDB./Membrane_Proteins_xtal.htmlTill July 19th, 2005, there are totally29016/pdb图2.2 PDB 库中可溶性蛋白和膜蛋白结构数据储存量随时间的增长图从1985年到今天的二十年间，膜蛋白结构生物学不断发展，特别是电子显微镜——电子二维晶体学、三维重构技术的加入，弥补了膜蛋白晶体的不足。
相分离技术分离纯化膜蛋白-翻译(精)
相分离技术分离纯化膜蛋白摘要相分离是用来纯化和浓缩洗涤剂溶膜蛋白的一种简单、高效且廉价的方法。
尽管如此，在膜蛋白科学中相分离并没有被广泛使用，并且只有相对较少的去污剂/膜蛋白的结合体具有随时可以使用的实验方案。
在这里，我们总结了影响用于膜蛋白研究的常见去污剂的相分离行为的理化参数。
并列举出了用这种方法以不同种类的去污剂纯化膜蛋白的成功例子。
在许多下游应用（如膜蛋白结晶或功能分析）中，去污剂的选择是至关重要的，我们讨论了对于一个给定的去污剂缓冲系统如何来给出新的相分离实验方案。
引言去污剂用来从生物膜中提取膜蛋白和调整它们在水溶液中的溶解度，这是进一步进行蛋白质纯化的先决条件[1]。
膜蛋白的纯化一般来说较为繁琐[2]，因为把它们从自身的膜环境移入到去污剂缓冲区，只能部分地模拟类脂膜的理化性质。
因此，提取后许多膜蛋白不能保留其生物活性，或者只能部分地或者只能在非常特殊的缓冲溶液中保留活性。
提取后，可用用于可溶性蛋白质的相同的层析法进行膜蛋白的纯化，其区别在于去污剂必须一直在缓冲区。
去污剂不会干扰离子交换或金属螯合色谱，只是有时候会干扰亲和层析法。
尺寸排阻色谱法中，结合去污剂会增加膜蛋白的表观分子量。
相分离技术是一个功能强大的、可替代或补充色谱法的纯化实验方案。
它可直接应用于溶膜，从可溶性蛋白质和其它亲水性杂质中分离出膜蛋白。
这种粗纯化实验方案可用于膜蛋白组学或者作为色谱纯化的第一步[3,4]。
另外，相分离可用于纯化后期的同时浓缩和和进一步纯化步骤[5]。
使用相分离的步骤来纯化膜蛋白有许多好处。
该方法具有操作简单、不需要复杂的实验设备、易进行试验放大、可以和大多数色谱结合使用等优点。
其中特别对于脱除亲水化合物是非常有效的。
此外，膜蛋白可以同时纯化和浓缩，可与采用（NH4）2SO4或其它盐的可溶性蛋白的沉淀实验方案的效率相比拟。
这种方法可能有的缺点是，高浓度的去污剂不利于蛋白的稳定以及会干扰生物化学试验和其结合过程。
中药膜蛋白质提取
中药膜蛋白质提取中药是中华文化的重要组成部分，也是我们传统的医学瑰宝。
中药中的有效成分是非常复杂的，其中不乏具有药用价值的蛋白质。
通过提取中药中的蛋白质，可以广泛应用于医学、保健品等多个领域。
中药膜蛋白质提取是提取中药中蛋白质的一种方法，下面我们就来详细介绍一下此方法的步骤。
一、中药材处理中药膜蛋白质提取过程中，中药材的处理非常重要。
首先，选用新鲜的中药材进行提取。
其次，需要对中药材进行研磨，制成适合操作的形态。
最后，将中药材用水或其他溶剂进行浸泡，使药材中的蛋白质在溶液中充分溶解。
二、蛋白质提取将浸泡好的中药材经过过滤、离心、超滤等一系列步骤，得到中药膜蛋白质的提取液。
一般情况下，膜过滤是最重要的步骤之一。
利用分子筛分离出分子较小的蛋白质，大分子多糖、脂质等杂质将无法通过膜孔，从而得到纯净的膜蛋白质提取物。
三、蛋白质分离、纯化通过电泳、色谱等方法对蛋白质进行分离和纯化。
电泳技术可以根据蛋白质的电性和分子大小等特性，将其分离出来；而色谱技术则是利用不同物质在固定相和流动相之间的亲和性和分子大小等特性来进行分离和纯化。
在这些步骤中，选择适当的分离和纯化方法对于提取纯净蛋白质非常重要。
四、蛋白质鉴定、分析对分离纯化得到的蛋白质进行结构、功能鉴定，确定蛋白质的主要作用。
通过质谱、圆二色谱、红外光谱等技术手段，确定蛋白质的分子量、构型、生物活性等参数，为进一步研究和开发提供依据。
综上所述，中药膜蛋白质提取是一个复杂、多步骤的过程。
这个过程需要科学严谨的操作，才能确保提取到纯净、高效的膜蛋白质。
中药膜蛋白质提取为中药材的深度开发和应用提供了强有力的支持，也使我们更好地保护和传承中华传统医药文化。
膜蛋白抽提
二、蛋白抽提谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。
由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取.但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。
膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol 等表面活性剂。
1、分离膜蛋白的方法（原则性）：1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。
（例如：michael11液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。
差速离心。
蔗糖密度梯度离心。
收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。
裂解即可收集膜蛋白）2 ）用特殊的去污剂选择性的分离。
从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。
蛋白提取方法
蛋白质提取的方法总汇 2005-4-15 23:00:00 来源：生命经1、植物组织蛋白质提取方法1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！2、植物组织蛋白质提取方法三氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！3、组织：肠黏膜目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min离心：12000 g，10min，4度，弃上清加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）振荡，置室温20min离心： 7500g，5 min，4度，弃上清重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次沉淀中加入100％乙醇 2ml充分振荡混匀，置室温20 min离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀1％SDS溶解沉淀离心：10000g，10min，4度取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。
膜蛋白抽取方法
哺乳动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。
膜蛋白的蛋白质组学分析是被大家看好的辨识新的药物靶标和/或疾病的生物学标记的好方法，并已得到广泛应用。
然而膜蛋白通过许多疏水氨基酸残基锚定在膜结构里面，很难溶解在水性缓冲液系统中。
为了制备膜蛋白样品，传统的方法是采用“去污剂＋机械处理”的操作方法获取膜蛋白，用于增溶的去污剂有离子型（如SDS）和非离子型的（如Triton?-X）等，前者会使多数蛋白完全变性，限制很多下游分析，而后者虽然相对温和，但抽提膜蛋白（特别是有多个跨膜区的膜蛋白）的效果往往很差。
下面推荐的是两个公司的相关产品，也算是具有代表性的两种方法：1．默克的跨膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract 跨膜蛋白抽提试剂盒（简称TM-PEK，货号71772-3）是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白制备试剂盒。
其简便的两步法操作可以高效地富集膜蛋白和膜关联蛋白。
试剂盒包括两种试剂，TM-PEK试剂A 和TM-PEK试剂B，分别用于制备抽提缓冲液2A和抽提缓冲液2B。
使用者通过实验摸索，可以根据特定目的蛋白的特点从中灵活选择最适缓冲液。
用ProteoExtract TM-PEK 试剂抽提得到的蛋白适合用于常见的各种蛋白分析方法。
从以下的报告中，列举了TM-PEK制备的跨膜蛋白和多次跨膜蛋白样品在免疫印迹、活性分析及2D电泳等方面的实例。
为了验证ProteoExtract跨膜蛋白抽提试剂盒抽提多次跨膜蛋白的有效性，我们用免疫印迹比较了Frizzled-4，CELSR-3（cadherin-EGF-lag seven-pass receptor-3）和EGFR（表皮生长因子，只有一个跨膜区）的样本制备效果。
Frizzled和CELSR是WNT/ PCP （平面细胞极性）通路的重要组成成分，而这个重要的通路则控制了组织的极性和细胞的迁移。
Frizzled蛋白与GPCRs有远源关系，但是除开都具有7个跨膜区的结构外，它们的结构和功能存在很大差异（参见Huang 2004）。
膜蛋白的结构
-螺旋 -折叠
-螺旋
Arrangement
Ribbon +
of atoms
C and N
showing
backbone
H bonds The N-H of every peptide bond is
hydrogen-bonded to the carbonyl
离子与K+ Channel的相互作用
K+ Channel如何开关？
形成selectivity filter的结构非常坚 固 ➢ 在通道开关过程中不发生构像变化
跨膜螺旋在通道开关过程中发生构像 变化 ➢ 其对孔的限制类似于照相机光圈
细菌K+ Channel的开关机制
(Jiang et al, Nature 417, 523, 2002)
k0
r·k0
k k
r
k0 o r·k
设在原点O处电子散射的电磁波的相位为零
在r处电子散射的电磁波与原点散射波的光程 差为
d r k r k0 r (k k0 )
k0为代表入射波的单位向量 k为代表散射波的单位向量
单个电子的散射波
k0
r·k0
k k
r
k0 o r·k
r处电子散射的电磁波相对于原点的相位为
➢ 根据电子密度的大小，可以推断出原子在空间 的分布，亦即分子结构
X-射线晶体学测定三维结构
晶体 crystal
衍射 diffraction = 傅立叶变换
结构 structure = 逆傅立叶变换
3.3 膜蛋白的结构
膜蛋白分为三类 内在蛋白 (integral protein)
或 intrinsic protein
膜蛋白结构生物学
第2章膜蛋白结构生物学研究膜蛋白是一类具有非常重要功能的蛋白，根据其在膜上的定位可以分为外周膜蛋白（镶嵌在膜表面）、穿膜蛋白（其膜外部分仅在膜的一边）和跨膜蛋白（膜的两边都有膜外部分），根据膜蛋白的穿膜方式分为单次跨膜蛋白和多次跨膜蛋白。
膜蛋白具有一个定位在细胞膜上的疏水区域，膜蛋白在没有去污剂存在的情况下是不溶于水的，因此在对膜蛋白进行体外研究时，我们经常需要选用一定的去污剂来融解膜蛋白；膜蛋白的提取、纯化和结晶与水溶性蛋白是有一定区别的。
下面列出了膜蛋白和膜蛋白研究的一些特点：z有大约百分之三十的基因是编码膜蛋白的z膜蛋白的种类繁多，如离子通道，受体，离子泵，转运蛋白等z膜蛋白在组织，细胞中的丰度比较低z膜蛋白极其疏水的特性使其纯化变得很困难z利用基因工程技术表达膜蛋白要比表达水溶性蛋白难很多z膜蛋白的纯化和结晶相对水溶性蛋白要难z膜蛋白晶体衍射比较弱，分辨率比较低膜蛋白结构生物学由于膜蛋白样品难于制备而远远落后于可溶性蛋白结构生物学的发展，1960年，第一个可溶性蛋白质（肌血球蛋白）的晶体结构得到解析[5]，并存入蛋白质结构数据库（PDB）中，此后PDB库中可溶性蛋白质的三维晶体结构数据不断增加，而关于膜蛋白的晶体结构记录为零。
人们曾经一度认为，膜蛋白是不可能得到晶体的。
直到1982年，这个错误的认识才被纠正过来，德国科学家H.Michel长出了世界上第一个膜蛋白晶体——紫细菌光反应中心（如图2.1），之后在三位德国科学家J.Deisenhofer, R.Huber和H.Michel 的共同努力下，他们于1985年公布了世界上第一个膜蛋白的三维精细晶体结构。
这是一个非常重大的成就，宣布了蛋白质晶体学向膜蛋白的进军，预示着许多重要的膜蛋白结构能够被解析。
因此，J.Deisenhofer, R.Huber和H.Michel三个人分享了1988年的Nobel化学奖。
2526J.Deisenhofer, H.Michel Science (245):1463,1989J.Dersenhofer, O.Epp, K.Miki, R.Huber, H.Michel, Nature (318):618,1985 J.Deisenhofer, O.Epp, K.Miki, R.Huber, H.Michel, J.Mol.Biol.(180):385,1984 H.Michel J.Mol.Biol.(158):567,1982First Membrane Protein Structure:Photosynthetic Reaction Center of Rhodopseudomonas virdis Complex (four subunits)solved in 1985 (1PRC)Nobel Chemistry Prize was awarded to J.Deisenhofer, R.Huber, H.Michel in 1988. 图2.1 世界上第一个膜蛋白的三维结构图 Till July 23rd, 2005, there are membrane protein structures deposited inPDB and total membrane protein structures in PDB./Membrane_Proteins_xtal.htmlTill July 19th, 2005, there are totally29016/pdb图2.2 PDB 库中可溶性蛋白和膜蛋白结构数据储存量随时间的增长图从1985年到今天的二十年间，膜蛋白结构生物学不断发展，特别是电子显微镜——电子二维晶体学、三维重构技术的加入，弥补了膜蛋白晶体的不足。
膜蛋白抽提[5篇模版]
![膜蛋白抽提[5篇模版]](https://img.taocdn.com/s3/m/130473090166f5335a8102d276a20029bc646353.png)
膜蛋白抽提[5篇模版]第一篇：膜蛋白抽提二、蛋白抽提谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。
由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取.但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。
膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。
1、分离膜蛋白的方法（原则性）：4)顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。
用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。
5)centrifugal protein extraction原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心评价：尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。
（codegreen）6)detergent-based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器(ER)，然后分级抽提方法。
例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。
膜蛋白提取方法(双向电泳)
膜蛋白提取试剂盒（双向电泳用）产品组成：产品组成 BB-3188-1 BB-3188-2规格 50T 100T试剂A 10ml 20ml试剂B 20ml 40ml试剂C 10ml 20ml蛋白酶抑制剂混合物 250μl 500μl储存条件：蛋白酶抑制剂-20℃保存；蛋白提取液A和B 2-8℃保存；试剂C室温保存。
有效期：一年。
产品简介：哺乳动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。
膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。
传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。
去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。
贝博双向电泳膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从细胞和动物组织提取双向电泳用膜蛋白样品。
提取过程简单方便，可在1小时内完成。
提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。
提取的蛋白可直接用于双向电泳蛋白研究。
使用方法：A．细胞蛋白提取1.取5-10×106个以上细胞①，在4℃，500g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.细胞样品中加入200μl冷的试剂A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10-15分钟。
4.再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，13000×g条件下离心5分钟。
5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃水浴5-10分钟，37℃下②1000g力离心3分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白部分约为20μl。
6.移除上层溶液和界面层，收集下层膜蛋白样品。
一般可直接跳过步骤7和步骤8直接进行步骤9，如果对膜蛋白样品纯度要求极高，可以进行步骤7或者步骤7和8，此时膜蛋白回收率会稍有降低。
7.用150-200μl冰冷的试剂B稀释下层膜蛋白样品，混匀后冰浴2min，37℃水浴5-10分钟，37℃下②1000g力离心3分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白部分约为20μl。
细菌总蛋白和膜蛋白提取方法
[【生物化学与分子生物学】]细菌总蛋白和膜蛋白提取方法膜蛋白, 细菌膜蛋白, 细菌一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。
该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。
2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。
3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。
4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。
缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。
2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。
每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。
3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。
每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。
4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。
每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g 离心5min，弃上清，重复洗涤2次。
最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。
5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。
相分离技术分离纯化膜蛋白-翻译
相分离技术分离纯化膜蛋白 摘 要 相分离是用来纯化和浓缩洗涤剂溶膜蛋白的一种简单、高效且廉价的方法。尽管如此，在膜蛋白科学中相分离并没有被广泛使用，并且只有相对较少的去污剂/膜蛋白的结合体具有随时可以使用的实验方案。在这里，我们总结了影响用于膜蛋白研究的常见去污剂的相分离行为的理化参数。并列举出了用这种方法以不同种类的去污剂纯化膜蛋白的成功例子。在许多下游应用（如膜蛋白结晶或功能分析）中，去污剂的选择是至关重要的，我们讨论了对于一个给定的去污剂缓冲系统如何来给出新的相分离实验方案。引 言 去污剂用来从生物膜中提取膜蛋白和调整它们在水溶液中的溶解度，这是进一步进行蛋白质纯化的先决条件[1]。膜蛋白的纯化一般来说较为繁琐[2]，因为把它们从自身的膜环境移入到去污剂缓冲区，只能部分地模拟类脂膜的理化性质。因此，提取后许多膜蛋白不能保留其生物活性，或者只能部分地或者只能在非常特殊的缓冲溶液中保留活性。 提取后，可用用于可溶性蛋白质的相同的层析法进行膜蛋白的纯化，其区别在于去污剂必须一直在缓冲区。去污剂不会干扰离子交换或金属螯合色谱，只是有时候会干扰亲和层析法。尺寸排阻色谱法中，结合去污剂会增加膜蛋白的表观分子量。 相分离技术是一个功能强大的、可替代或补充色谱法的纯化实验方案。它可直接应用于溶膜，从可溶性蛋白质和其它亲水性杂质中分离出膜蛋白。这种粗纯化实验方案可用于膜蛋白组学或者作为色谱纯化的第一步[3,4]。另外，相分离可用于纯化后期的同时浓缩和和进一步纯化步骤[5]。 使用相分离的步骤来纯化膜蛋白有许多好处。该方法具有操作简单、不需要复杂的实验设备、易进行试验放大、可以和大多数色谱结合使用等优点。其中特别对于脱除亲水化合物是非常有效的。此外，膜蛋白可以同时纯化和浓缩，可与采用（NH4）2SO4或其它盐的可溶性蛋白的沉淀实验方案的效率相比拟。这种方法可能有的缺点是，高浓度的去污剂不利于蛋白的稳定以及会干扰生物化学试验和其结合过程。渗析或其他方法与去污剂吸收或凝胶过滤一样，可能需要从溶液中除去多余的去污剂。 本文中，我们描述了影响用于膜蛋白纯化的不同类别去污剂的相分离的理化参数。并论述了成功的相分离技术的实验方案，以及如何调整实验方案用于新的去污剂缓冲体系。
什么是膜蛋白
膜蛋白膜蛋白(Membrane Protein)是指能够结合或整合到细胞或细胞器的膜上的蛋白质的总称。
而细胞中一半以上的蛋白质可以与膜以不同形式结合。
根据与膜结合强度的不同，膜蛋白可以被分为两类：外周膜蛋白和内在膜蛋白。
主要类型∙内在膜蛋白是整合于膜上的蛋白质，总是与膜结合在一起。
可以定义为需要通过人工加入去垢剂（如SDS或Triton X-100）或其他非极性溶剂才能够从膜中分离出来的蛋白质。
内在膜蛋白还可以根据与双分子膜之间结合关系的差异细分为：o跨膜蛋白，顾名思义即跨越膜的两端的蛋白质，其跨膜部分为β桶或α螺旋结构；o单向内在膜蛋白，其只从一个方向（膜外或膜内）与膜结合，虽然部分插入膜中，但不跨膜。
∙外周膜蛋白是能够暂时与膜或内在膜蛋白结合的蛋白质，主要是通过疏水、静电和其他非共价相互作用来进行结合，这种结合可以通过加入极性试剂，如高pH或高盐溶液来破坏。
内在膜蛋白和外周膜蛋白都可以被翻译后修饰，如加上脂肪酸链和异戊二烯化（Prenylation），有助于与脂膜的结合。
延伸阅读∙Protein-lipid interactions (Ed. L.K. Tamm) Wiley, 2005.∙Popot J-L. and Engelman D.M. 2000. Helical membrane protein folding, stability, and evolution. Annu. Rev. Biochem. 69: 881-922.∙Bowie J.U. 2005. Solving the membrane protein folding problem. Nature 438: 581-589.∙Cho, W. and Stahelin, R.V. 2005. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34: 119–151.∙Goni F.M. 2002. Non-permanent proteins in membranes: when proteins come as visitors.Mol. Membr. Biol. 19: 237-245.∙Johnson J.E. and Cornell R.B. 1999. Amphitropic proteins: regulation by reversible membrane interactions. Mol. Membr. Biol. 16: 217-235.∙Seaton B.A. and Roberts M.F. Peripheral membrane proteins. pp. 355-403. In Biological Membranes (Eds. K. Mertz and B.Roux), Birkhauser Boston, 1996.。
膜蛋白纯化方法范文
膜蛋白纯化方法范文膜蛋白是一类存在于细胞膜上的重要蛋白质，起着许多重要的生物学功能。
为了研究膜蛋白的结构和功能，需要对其进行纯化。
然而，膜蛋白的纯化相对困难，主要是由于其高度疏水的性质和复杂的表达、折叠和定位过程。
本文将介绍几种常用的膜蛋白纯化方法。
1.高速离心：高速离心是最常用的初步膜蛋白纯化方法之一、该方法利用差速离心将细胞破碎，得到胞浆和质膜颗粒的混合物。
然后通过多次离心，逐步提高离心速度，最终得到膜蛋白的富集颗粒。
2.界面活性剂提取法：界面活性剂提取法是一种广泛应用于膜蛋白纯化的方法。
该方法通过在非离子型或阳离子型界面活性剂存在下将膜蛋白从膜上溶解转移到溶液中。
通常选用的界面活性剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠和短链磷脂。
4.高效液相色谱：高效液相色谱是一种常用于膜蛋白纯化的分离技术。
该方法利用柱上填充的固定相，通过控制溶液中的成分在固定相和流动相之间的分配，实现膜蛋白的分离纯化。
常用的高效液相色谱包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、逆流色谱等。
5.电泳分离：电泳是一种通过电场作用将膜蛋白根据其大小和电荷分离的方法。
电泳可以分为凝胶电泳和非凝胶电泳两种。
凝胶电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-等。
非凝胶电泳主要包括等电聚焦电泳和二维电泳。
除了这些传统的膜蛋白纯化方法之外，还有一些新的技术在膜蛋白纯化中得到了应用，例如固相提取、膜抓捕技术、质谱分析等。
这些新技术的应用，为膜蛋白纯化带来了更高的效率和准确性。
总结起来，膜蛋白的纯化方法有很多，每种方法都有其适用的场景和特定的优缺点。
研究人员可以根据具体的实验需求和条件选择合适的纯化方法，以获得高质量的膜蛋白样品。
biovision膜蛋白提取
biovision膜蛋白提取BioVision膜蛋白提取膜蛋白是细胞膜的主要组成成分，具有重要的生物学功能。
它们参与细胞信号传导、物质运输以及细胞间相互作用等关键过程。
为了研究膜蛋白的结构和功能，科学家们开发了多种方法来提取膜蛋白。
其中，BioVision膜蛋白提取试剂盒是一种常用的工具，它可以高效地从细胞中提取膜蛋白。
BioVision膜蛋白提取试剂盒采用一种特殊的离子洗涤剂和蛋白酶抑制剂的组合，能够迅速破坏细胞膜，并保护膜蛋白不被降解。
该试剂盒的提取步骤简单、操作方便，适用于各种类型的细胞，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞等。
使用BioVision膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白的步骤如下：1. 细胞培养：首先，将所需的细胞培养在适当的培养基中，使其达到指定的生长状态。
2. 细胞收集：收集细胞后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，去除培养基和杂质。
3. 细胞裂解：将洗涤后的细胞加入BioVision提取试剂，充分裂解细胞膜，释放膜蛋白。
可以通过旋转离心等方法加速细胞裂解过程。
4. 膜蛋白提取：离心裂解后的细胞，将上清液转移到新的离心管中，以去除细胞碎片和细胞核等杂质。
上清液中富含膜蛋白。
5. 蛋白质浓度测定：使用蛋白质浓度检测试剂盒，测定提取的膜蛋白的浓度。
根据需要，可以调整蛋白质的浓度。
BioVision膜蛋白提取试剂盒的优势在于其高效性和可靠性。
该试剂盒能够完整地提取细胞膜中的蛋白质，并保持其天然的结构和功能。
此外，BioVision提供的试剂盒还具有良好的稳定性和重复性，可以在不同实验条件下反复使用。
膜蛋白提取是研究细胞生物学和蛋白质功能的关键步骤之一。
BioVision膜蛋白提取试剂盒的出现，为科学家们提供了一种高效、方便的方法来提取膜蛋白。
通过使用这种试剂盒，研究人员可以更深入地探究膜蛋白的功能和相互作用，从而推动细胞生物学和生物医学研究的进展。
BioVision膜蛋白提取试剂盒是一种有效的工具，可用于从细胞中提取膜蛋白。
膜蛋白
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分类
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膜蛋白外在膜蛋白分布在膜的内外表面，约占膜蛋白的20%～30%，主要在内表面，为水溶性蛋白，它通过 离子键、氢键与膜脂分子的极性头部相结合，或通过与内在蛋白的相互作用，间接与膜结合。
膜蛋白（左：外周膜蛋白与内在膜蛋白；右：脂锚定蛋白） 内在蛋白约占膜蛋白的70%～80%，是双亲媒 性分子，可不同程度的嵌入脂双层分子中。有的贯穿整个脂双层，两端暴露于膜的内外表面，这种类型的膜蛋白 又称跨膜蛋白。内在膜蛋白露出膜外的部分含较多的极性氨基酸，属亲水性，与磷脂分子的亲水头部邻近；嵌入 脂双层内部的膜蛋白由一些非极性的氨基酸组成，与脂质分子的疏水尾部相互结合，因此与膜结合非常紧密。据 估计人类基因中，1/4~1/3基因编码的蛋白质为内在膜蛋白。
表达
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常用于重组膜蛋白的表达系统有真核表达系统、原核表达系统和近些年来发展的无细胞表达系统。其中以大 肠杆菌（E.coli）为代表的原核表达系统因为操作简单、成本相对低廉、遗传背景清楚、方便同位素标记，以及 有大量可利用的表达载体和宿主菌株等原因，是当下获取重组膜蛋白的最主要途径。对于一些膜蛋白而言，采用 增加蛋白可溶性或者促使蛋白形成包涵体的标签进行融合表达，是很好的增加蛋白产量的办法，但是暂时还没有 普遍有效的融合标签可用于所有膜蛋白的超量表达。
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蛋白[membrane protein]的分离一、简介：1 细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。
1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。
1935年Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。
1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+3.5(亮)+2（暗）=7.5细胞质膜的主要功能概括如下：(1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2) 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。
2 膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。
根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。
(1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。
(2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。
获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。
附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用２－Ｄ技术也好，ＩＣＡＴ乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。
二、蛋白抽提谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。
由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取.但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。
膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。
1、分离膜蛋白的方法（原则性）：1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。
（例如：michael11液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。
差速离心。
蔗糖密度梯度离心。
收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。
裂解即可收集膜蛋白）2 ）用特殊的去污剂选择性的分离。
从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。
一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。
利用此性质可提取膜蛋白。
3 )膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。
羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。
利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。
层析柱提取（参步骤）4) 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。
用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。
5)centrifugal protein extraction评价：尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。
（codegreen）6)detergent- based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器(ER)，然后分级抽提方法。
例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。
而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。
总的感受：细胞的量要很充足。
之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。
纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。
到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。
2、分离膜蛋白的方法（操作）1）分离细胞膜蛋白的方法：1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTAbuffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2）分离细胞膜蛋白的方法：1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。
4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min5、收集水相留作分析6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验试剂：1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。
5）、蛋白酶抑制剂2、缓冲液A（含0。
5mol/LNaCl的RIPA buffer）3、buffer C10mmol/L Tris HCl(pH7.5)150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA(PH7.5)3）分离细胞膜蛋白的方法：7M urea2M thiourea4%chaps2.5%sb3-101000000个细胞，可用此buffer 1ml。
冰浴匀浆。
冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min。
取上清-20保存。
4）分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3、100000g，4℃离心1hr。
弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
5）分离组织膜蛋白的方法：RIPA1XPBS1%NP400.5去氧胆酸钠0.1%SDS以下用时加入10mg/ml PMSF异丙醇（终浓度10ul/ml）Aprotinin（30ul/ml）1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPA buffer 1ml。