高效液相色谱分析方法开发

揭秘--------选择合适的起始条件
选用通用的色谱柱
一般直接选用C18(或C8) 5um 12.5, 15, 25cm 长的色谱柱
不同的样品不同的思路
中性化合物无需调整流动相的pH值;而对于含有带电基团的 化合物,则需要用缓冲溶液调整流动相的pH值;有时需要 化合物, 采用离子对反相色谱
选择流动相
流动相的调整"秘诀" 流动相的调整"秘诀"
秘诀4 秘诀4
更换流动相的组成
在第三步,我们已经基本上得到了一个合适的 保留因子,如果还有一些组分的分离情况不好, 则应考虑更换流动相的组成(如有机溶剂类型的 改变,pH值的改变或是加入离子对试剂,等等), 或者,索性改变固定相的类型.
2002-9
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开发分析方法的规则
合适的保留因子k (k值1-20)是获得满意分离的基础 合适的保留因子k 20)
保留因子
k=(tR-tM)/tM
用以下"秘诀"可以使您的开发过程更加简便,快 用以下"秘诀"可以使您的开发过程更加简便,
速
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流动相的调整"秘诀" 流动相的调整"秘诀"
秘诀wenku.baidu.com 秘诀2
三倍规则
每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量, 保留因子约增加3倍,此为三倍规则.这是 一个聪明而又省力的办法.调整的过程中, 注意观察各个峰的分离情况.
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色谱柱的调整
最后
根据操作压力,出峰时间, 根据操作压力,出峰时间,分离度 来调节色谱柱的长度, 来调节色谱柱的长度,粒径以及 流动相流速, 流动相流速
从而
获得最佳的分离
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�
甲醇/水或乙腈/水(依据个人习惯而定)
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流动相的调整" 流动相的调整"秘诀"
秘诀1
试验,
由强到弱
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行 这样可以很快地得到分离结果,然后根据出峰情况
调 整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例.
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流动相的调整"秘诀" 流动相的调整"秘诀"
秘诀3 粗调转微调
当分离达到一定程度,应将有机溶剂
10%的改变量调整为5%,并据此规则
逐渐降低调整率,直至各组分的分离 情况不再改变.
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HPLC 分析方法开发
分析方法开发三步骤
选择合适的色谱柱(固定相)和流动 选择合适的色谱柱(固定相) 相,得到合理的保留时间 调整选择性以及各个色谱峰的分离度
调整流速,填料粒径,色谱柱规格(长度及内径) 调整流速,填料粒径,色谱柱规格(长度及内径) 以获得最佳的分离
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