荧光原位杂交ppt课件

探针制备
所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其 他标记物（如酶与荧光素等）标记的与目的基因互 补的 DNA 片段或单链 DNA 或 RNA。根据其来 源可分为“cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探 针与 RNA 探针”。 1.“cDNA探针” 以 mRNA 为模板——在逆转录酶 的催化下合成一条与 mRNA 互补的DNA链（
Applications of FISH
基因组结构研究； 染色体精细结构变异分析； 病毒感染分析； 人类产前诊断； 肿瘤遗传学；
基因组结构研究
染色体精细结构变异分析
Viral Infections
Prenatal Diagnosis
以21号染色体的相应片段序列 作探针，与外周血中的淋巴细 胞或羊水细胞进行原位杂交， 可快速、准确进行诊断。
直接标记：是通过荧光素直接与探针核苷 酸或 磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口 平移法标记探针时掺入荧光素核苷三磷酸 标记探针。（检测步骤简单，但不能将信 号放大，不如间接标记的探针灵敏）
切口平移法：
切口平移标记法先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口， 大肠杆菌 DNA聚合酶I 作用以切口处开始，以另一条DNA链为 模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷 酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均 一标记DNA链。 （引物延伸法） 本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板互 补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3’-OH的末端开始 合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模序列互 补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供3’-OH端。
FISH技术的优点
FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点：
1、荧光试剂和探针经济、安全； 2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探 针相当； 5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多 种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可 以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
3.“寡核苷酸探针”为人工合成的DNA片段，一 般长约20-50个bp（碱基）。可根据已知DNA 或RNA序列合成精确互补的DNA探针；如不知 核酸序列，可依据其蛋白产物的氨基酸顺序推 导出核酸序列合成DNA探针。由于DNA自动合 成仪的出现使探针的合成十分方便。
探针的非放射性标记
间接标记：是采用生物素标记DNA探针， 杂交 后再用联有荧光素的抗生物素 抗体检测。（可将检测信号放大，监测到 小至５00 bｐ的靶序列）
探针类型
1、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵 母人工染色体、细菌人工染色体，主要用以识别染色体的 易位、缺失和扩增。 2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的 全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检 测染色体数目或结构异常。 3、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星 DNA 重 复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异 常。
FISH发展
1969年，同位素标记的DNA探针； 1974年，染色体显带技术与原位杂交结合； 1981年，荧光素标记的cDNA探针； 90年代后，多色探针出现。
探针的发展
放射性标记：很难满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的 条件，灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（P32），档标 记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低；如果使用 低辐射能的放射性标记物（3H）可以得到较高分辨率，但由于 灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致北京过高而难以分辨 出真正信号。
染色体涂染探针：判断易位染色体
8号染色体探针
α-卫星DNA是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着 丝粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的单体为单位 组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝 粒DNA区域，其杂交将产生很强的杂交信号。因此常被选为着丝粒探针 的来源。
荧光原位杂交（FISH）
Fluorescence in situ hybridization
L/O/G/O
FISH原理
以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变 性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火 形成稳定的异源双链DNA，通过荧Hale Waihona Puke Baidu标记显示出来，通过荧光显微镜 观察杂交信号。
非放射性标记：常用的有生物素与荧光素。生物素一般通过连 接到 dUTP 等核苷三磷酸上，这种经修饰的核苷三磷酸再通 过酶促反应掺入到探针中；荧光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶 作用下掺入到探针中去，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（ FITC）、羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、 吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等
谢 谢
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