fish-荧光原位杂交.ppt

1+
2+
3+
正常
Her2基因低度表达
Her2基因高度表达
或者室温风干。
三、探针准备
1.室温下让探针复温，降低探针的黏度，以便 探针充分准确吸取。
2.涡流混合。把内容物装入试管底部，每个试 管用台式离心机离心2-3秒，然后再次轻 轻涡流混合。
四、杂交
1 .加10uL混合后的探针到载玻片的靶区，立刻在探 针上加盖盖玻片，让探针均匀的在盖玻片下扩 散。气泡会干扰杂交应该避免。探针使用后需 要及时再冷冻保存。
5min×2次，室温风干。
二、样品变性
1.将变性液倒入染色缸中，水浴加热至72±1oC，片 子放入前确认温度已达到72±1oC。（变性液倒入 染色缸中水浴加热约需30min）
2.放入波片至变性液中，继续72±1oC变性5min。 3.取出波片至70%冷乙醇中浸泡1min。 4.85%、100%冷乙醇各脱水1min。 5.吸去多余的乙醇，置于40oC-50oC烤片机上2-5min
▪ FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸 为探针，按照碱基互补的原则，与待检材 料中未知的单链核酸进行特异性结合，形 成可被检测的杂交双链核酸。
探针
➢ 染色体特异重复序列探针；
如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重 复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测。
➢ 全染色体或染色体区域特异性探针；
2×SSC。
▪ 6）杂交后洗液：100ml 2×SSC+0.3ml NP-40。
▪ 7）70%、85%、100%乙醇，置于-20oC保存。
▪ 8）DAPI溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储 存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作 液。（DAPI—4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-
把载玻片浸入杂交后缓冲洗液中72±1℃2min。 4.从杂交后缓冲液中移出载玻片，把载玻片放在暗
处竖立空气中干燥。
六、衬染及封片
1.加10uL DAPI复染载玻片靶区并加盖盖 玻片。
2.荧光显微镜观察或在暗处-20oC保存。
荧光显微镜观察FISH结果
▪ FISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在 的位置，以HER-2 DNA Probe来说，它会把 HER-2基因部位橘红色荧光亮点，还将第17 对染色体的中心颗粒（centromere）呈现绿 色亮点，我们只要对比橘色和绿色亮点的 数目，若橘色点/绿色点大于2，就表示有 HER-2扩增，正常细胞橘色点/绿色点数目 比值小于2。
由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成
➢ 特异性位置探针。
由一个或几个克隆序列组成
实验相关溶液的配置
▪ 1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，加水 至1000mL（用10mol/L NaOH调pH 至7.0）。
▪ 2）2×SSC：40ml 20×SSC+360ml H2O。 ▪ 3）0.2N Hcl：0.5ml浓Hcl+29.5ml H20。 ▪ 4）10%中性福尔马林：4ml甲醛+36mlPBS。 ▪ 5）变性液（pH7.0）：24.5ml甲酰胺+10.5ml
0.2N Hcl处理 20min
蒸馏水Leabharlann Baidu
3min
2×SSC
3min×2次，室温晾干
预处理液80oC反应40min（预处理液需预热）
蒸馏水
1min
3.蛋白酶处理：
吸干组织周围液体后，加蛋白酶在37oC反应15min（蛋白酶需预热， 片子需放在湿盒上滴加）
4.后固定：
10%中性福尔马林 10min
2×SSC
2. 在盖玻片的周围注射少量的树胶于盖玻片和载玻 片交界处重叠，在盖玻片和载玻片周围形成密 封圈。
3.将封好的片子放入37oC预热的杂交盒中盖紧盖子，
孵育14-18h。
五、杂交后洗涤
1.从杂交盒中取出片子，用镊子轻轻拉掉密封胶。 2.将片子放入预热过的杂交后缓冲洗液
（2XSSC/0.3%NP-40）中，漂洗掉盖玻片。 3.盖玻片小心被去掉后，吸干载玻片边缘过多液体，
荧光原位杂交
Fluorescence in situ hybridization （FISH）
▪ 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞 遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有 的放射性原位杂交技术的基础上发展起来 的一种非放射性原位杂交技术。
phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料 ；
antifade—抗荧光淬灭剂 ）
实验方法和步骤
➢ 标本前处理 ➢ 样品变性 ➢ 探针准备 ➢ 杂交 ➢ 杂交后洗涤 ➢ 衬染及封片
一、标本前处理
1.脱蜡：
依次通过二甲苯15min×3次，无水乙醇10min×3次，室温风干。
2.预处理：