荧光原位杂交

探针的非放射性标记
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间接标记：是采用生物素标记DNA探针，杂交 后再用联有荧光素的抗生物素抗体检测。（可 将检测信号放大，监测到小至５00 bｐ的靶序 列）
直接标记：是通过荧光素直接与探针核苷酸或 磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记 探针时掺入荧光素核苷三磷酸标记探针。（检 测步骤简单，但不能将信号放大，不如间接标 记的探针灵敏）
种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可
以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
Applications of FISH
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➢ 基因组结构研究； ➢ 染色体精细结构变异分析； ➢ 病毒感染分析； ➢ 人类产前诊断； ➢ 肿瘤遗传学；
基因组结构研究
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探针制备
所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其他标记物（如酶与荧光素等）标记的与 目的基因互补的 DNA 片段或单链 DNA 或 RNA。根据其来源可分为“cDNA探针、基因组探 针、寡核苷酸探针与 RNA 探针”。 1.“cDNA探针” 以 mRNA 为模板——在逆转录酶的催化下合成一条与 mRNA 互补的DNA链 （cDNA）——用碱除去mRNA
荧光原位杂交（FISH）
Fluorescence in situ hybridization
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FISH原理
以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA 变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下 退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光 显微镜观察杂交信号。
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FISH技术的优点
FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点：
1、荧光试剂和探针经济、安全； 2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探
针相当； 5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多
探针类型
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1、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵 母人工染色体、细菌人工染色体，主要用以识别染色体的 易位、缺失和扩增。
2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的 全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检 测染色体数目或结构异常。
3、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星 DNA 重 复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异 常。
非放射性标记：常用的有生物素与荧光素。生物素一般通过连 接到 dUTP 等核苷三磷酸上，这种经修饰的核苷三磷酸再通过 酶促反应掺入到探针中；荧光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作 用下掺入到探针中去，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素 （FITC）、羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、 吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等
2.“基因组探针”是把染色体DNA通过超声击断或以限制性内切酶不完全水解——获得许 多染色体DNA随机片段——择长度约15-20kb（千对碱基）的DNA片段重组到λ噬菌体中— —经体外包装转染大肠杆菌——筛选出含目的基因的大肠杆菌——扩增后提取质粒—— 酶切分离目的基因。
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染色体精细结构变异分析
Viral Infections
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Prenatal Diagnosis
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以21号染色体的相应片段序列 作探针，与外周血中的淋巴细 胞或羊水细胞进行原位杂交， 可快速、准确进行诊断。
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切口平移法：
切口平移标记法先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口， 大肠杆菌 DNA聚合酶I 作用以切口处开始，以另一条DNA链为 模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷 酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均 一标记DNA链。 （引物延伸法） 本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板互 补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3’-OH的末端开始 合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模序列互 补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供3’-OH端。
FISH发展
➢ 1969年，同位素标记的DNA探针； ➢ 1974年，染色体显带技术与原位杂交结合； ➢ 1981年，荧光素标记的cDNA探针； ➢ 90年代后，多色探针出现。
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探针的发展
放射性标记：很难满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的 条件，灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（P32），档标 记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低；如果使用 低辐射能的放射性标记物（3H）可以得到较高分辨率，但由于 灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致北京过高而难以分辨 出真正信号。
3.“寡核苷酸探针”为人工合成的DNA片段，一般长约20-50个bp（碱基）。可根据 已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针；如不知核酸序列，可依据其蛋白产物的 氨基酸顺序推导出核酸序列合成DNA探针。由于DNA自动合成仪的出现使探针的合成 十分方便。
4.“RNA探针”制备的技术路线为：将一段含完整或部分基因的DNA片段插入重组质 粒的多克隆位点——以内切酶在插入片段中某一适当部位或在插入片段下游的某一 部位消化重组质粒——使之成为线性DNA——在相应的DNA依赖性RNA聚合酶催化下， 以含目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。由于RNA探针为单链，杂交时不存在第 二条链的竞争，所以其敏感性较经缺口平移标记的
染色体涂染探针：判断易位染色体
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8号染色体探针
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α-卫星DNA是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着 丝粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的单体为单位 组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝 粒DNA区域，其杂交将产生很强的杂交信号。因此常被选为着丝粒探针 的来源。