荧光原位杂交ppt
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分子病理检测平台原位杂交PPT课件
❖ CEN-17均值<1.75 亚二体性
❖ CEN-17均值 1.76-2.25 二体性
❖ CEN-17均值 2.26-3.75 低多体性
❖ CEN-17均值>3.76
高多体性
29ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
乳腺癌HER-2 FISH评分标准
石蜡切片（ASCO/CAP 2013指南）
➢ 计数至少30个细胞，统计Ratio值（Ratio值＝30个细胞核中红/绿）。 Ratio≥2.0或者＜2.0但HER-2信号数为≥6.0，结果为阳性，提示基因扩增； Ratio＜2.0且HER-2信号数＜4.0为阴性结果，提示样本无基因扩增； Ratio＜2.0且4.0≤HER-2信号数＜6.0时结果为不确定，可以选择增加计数 胞至100个,或重做FISH实验来判断最终结果。
❖ 1.EBER ❖ 2.HPV ❖ 3. Kappa和Lamda
❖ 荧光原位杂交的原理及探针类型 ❖ 荧光原位杂交的应用
❖ 1.实体性肿瘤 ❖ 2. 淋巴造血系统肿瘤 ❖ 3. 产前诊断
20
荧光原位杂交（FISH）
❖ 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA 靶序列杂交
❖ 用途：检测基因异常
❖ 2.淋巴造血系统疾病
❖ 淋巴瘤诊断分型，检测特异染色体易位，协助淋巴瘤分类； ❖ 慢性粒细胞白血病等白血病及多发性骨髓瘤FISH检测，判断预后等。
❖ 3.产前诊断
❖ 唐氏综合症（21三体）等产前染色体数目检测，协助产前诊断。
22
结果判读、分析
❖ 计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞，细胞核轮廓 不清或有重叠的不要分析。
❖ 1.基因片段扩增
2.基因片段缺失
3.基因片段易位
FISH实验ppt课件
学和环境微生物学研究的有力工具。FISH 技术可以再现微环 境中完整细胞的景象信息, 具有更好的精确性,因此在环境微
生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术
研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄 居群落等。
食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养 分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结 果需要1-2 d，致病位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研 究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了 解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序
列在染色体上的位置。
二、FISH实验及图例展示
• 1、样本的准备与处理
• 2、实验操作及注意事项
• 3、实验结果的检测 • 4、实验图例的展示
间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技
术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位
杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组
织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合 成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测 核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
2、FISH的发展
• 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获 得成功。
现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通 俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时
进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基
因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实 验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服 务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP， QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。
生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术
研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄 居群落等。
食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养 分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结 果需要1-2 d，致病位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研 究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了 解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序
列在染色体上的位置。
二、FISH实验及图例展示
• 1、样本的准备与处理
• 2、实验操作及注意事项
• 3、实验结果的检测 • 4、实验图例的展示
间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技
术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位
杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组
织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合 成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测 核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
2、FISH的发展
• 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获 得成功。
现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通 俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时
进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基
因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实 验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服 务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP， QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。
荧光原位杂交 ppt课件
荧光原位杂交 ppt课件
L/O/G/O
FISH原理
以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变 性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火 形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光显微镜 观察杂交信号。
探针制备
所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其 他标记物（如酶与荧光素等）标记的与目的基因互 补的 DNA 片段或单链 DNA 或 RNA。根据其来 源可分为“cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针 与 RNA 探针”。 1.“cDNA探针” 以 mRNA 为模板——在逆转录酶 的催化下合成一条与 mRNA 互补的DNA链（
Prenatal Diagnosis
以21号染色体的相应片段序列 作探针，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ外周血中的淋巴细 胞或羊水细胞进行原位杂交，
可快速、准确进行诊断。
谢谢
xxxxxxxxxxx
2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的 全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检 测染色体数目或结构异常。
3、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星 DNA 重 复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异
常。
染色体涂染探针：判断易位染色体
8号染色体探针
α-卫星DNA是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着 丝粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的单体为单位 组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝 粒DNA区域，其杂交将产生很强的杂交信号。因此常被选为着丝粒探针 的来源。
直接标记：是通过荧光素直接与探针核苷 酸或 磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口 平移法标记探针时掺入荧光素核苷三磷酸 标记探针。（检测步骤简单，但不能将信 号放大，不如间接标记的探针灵敏）
L/O/G/O
FISH原理
以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变 性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火 形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光显微镜 观察杂交信号。
探针制备
所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其 他标记物（如酶与荧光素等）标记的与目的基因互 补的 DNA 片段或单链 DNA 或 RNA。根据其来 源可分为“cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针 与 RNA 探针”。 1.“cDNA探针” 以 mRNA 为模板——在逆转录酶 的催化下合成一条与 mRNA 互补的DNA链（
Prenatal Diagnosis
以21号染色体的相应片段序列 作探针，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ外周血中的淋巴细 胞或羊水细胞进行原位杂交，
可快速、准确进行诊断。
谢谢
xxxxxxxxxxx
2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的 全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检 测染色体数目或结构异常。
3、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星 DNA 重 复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异
常。
染色体涂染探针：判断易位染色体
8号染色体探针
α-卫星DNA是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着 丝粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的单体为单位 组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝 粒DNA区域，其杂交将产生很强的杂交信号。因此常被选为着丝粒探针 的来源。
直接标记：是通过荧光素直接与探针核苷 酸或 磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口 平移法标记探针时掺入荧光素核苷三磷酸 标记探针。（检测步骤简单，但不能将信 号放大，不如间接标记的探针灵敏）
原位杂交技术ppt课件
10
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern 印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
49
（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
50
五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮 或脱片
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
27
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern 印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
49
（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
50
五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮 或脱片
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
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(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
荧光原位杂交技术在临床病埋中的应用 ppt课件
Blue单通道
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
二、常用探针种类
• 单色探针(single color probe, SC) • 双色探针(dual color probe, DC) • 三色探针(triple color probe, TC) • 双色分离探针(dual color, break apart probe. DC,BCR) • 双色单融合探针(dual color, single fusion. DC, SF
CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、 复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等 风险GIST中无扩增，其表达与GIST有预后相关性。
MDM2基因扩增宣GIST患者有预后相关性。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
前列腺癌
• 探针：PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG
套细胞淋巴瘤
• 探针：CCND1/IGH（双色双分离探针）
CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32。 CCND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达，可促进细胞 增生。
• CCND1/IGH融合基因检测意义
CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，FISH探 针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96%。
• 检测意义：
PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。 FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重 要过程。 没有ERG基因改变的前列腺癌患者8年生存期达90%。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
神经母细胞瘤、神经胶质瘤
• 探针：1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11
• MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义
荧光原位杂交检测ppt课件
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❖辅助血液疾病的诊断，判断预后，疗效检测及 微小残留检测
❖ 应用：
❖骨髓移植术后（性别不同的移植献者）、 性别鉴定 、CMPD和ALL初诊、CML末次化 疗结束两周 以上、AML-M3/M2等疾病
❖ 技术特点
❖ 可分析间期细胞，不需培养；操作简单、检测快速 重复性好、空间定位精确；灵敏性和特异性高
❖ 禁忌：冰冻或凝块
注意：建议做FISH的同时做常规细胞遗传学分析。若 只要求做FISH，请转交一份近期的细胞遗传学报告 。如果无细胞形态学或遗传学的检查，建议作进一 步检查！！
❖ 报告时间：周一至周五，7个工作日
❖ 报告示例：略
❖ 结果判读：每个探针检测镜下分析200个细胞核。 20例没有造血系统疾病且核型正常的骨髓标本作为 正常对照，以此计算分裂信号的平均数和标准差。 如果有异常杂交信号的细胞百分比超过正常标准差 的3倍，结果将被认为异常。
荧光原位杂交（FISH）检测
概述
FISH-目前新兴的分子遗传学技术，原理是采用
荧光标记的DNA探针，利用探针与检测样本中 DNA碱基对的互补性，在探针与标本的DNA杂交 后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从 而检测细胞、组织样本中的染色体和体和基因的异常
❖ 当染色体核型分析不成功或不明确时，可利用FISH 检测弥补不足，并可发现复杂易位
❖ 探针种类
❖双色单融合探针 双色分离探针
❖ ES探针
双色双融合探针
每类探针的检测和适用范围不同，决定其用处不同
❖ 标本要求
❖ 送检标本：骨髓3ml（CML和CLL患者可直接用外 周血2ml）
❖ 保存条件：肝素钠抗凝，4摄氏度，24h送检
原位杂交组织化学幻灯片PPT
当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双 链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降 或pH恢复到中性（复性），单链会按照碱基互补配 对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。 无论两条单链来源是否相同，只要它们之间的碱基 顺序互补或者部分互补，在条件适宜时，就可以全 部或部分复性，产生分子杂交重和多重原位杂交技术
放射性同位素和非放射性标记探针的双重标 记原位杂交
常用的放射性同位素标记物为35S，非放射性标 记物为生物素和地高辛。
非放射性标记探针的双重标记原位杂交
应用生物素和地高辛标记探针的双重标记原位 杂交
双重荧光标记原位杂交
两种同位素标记探针的双重标记原位杂交
探针长度 50-300个碱基，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂 交率高，杂交时间短。
探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。
杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便， 将杂交液和标本孵育过夜
四、杂交后处理
杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度 盐溶液的漂洗
间接FISH
Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号
3. 多色FISH
通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合 (直接法)，在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜 色标记，同时检测多种染色体异常。
多色FISH
4.FIBER FISH
将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维， 然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后 用荧光显微镜观察结果并分析.
包含了PCR和FISH二种方法的特点，在染色体重排方面可 选择性的代替FISH技术，在使用PRINS技术时,用简单的寡 核苷酸引物代替探针，原位标记染色体，消除了制备DNA 探针困难的问题。
放射性同位素和非放射性标记探针的双重标 记原位杂交
常用的放射性同位素标记物为35S，非放射性标 记物为生物素和地高辛。
非放射性标记探针的双重标记原位杂交
应用生物素和地高辛标记探针的双重标记原位 杂交
双重荧光标记原位杂交
两种同位素标记探针的双重标记原位杂交
探针长度 50-300个碱基，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂 交率高，杂交时间短。
探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。
杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便， 将杂交液和标本孵育过夜
四、杂交后处理
杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度 盐溶液的漂洗
间接FISH
Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号
3. 多色FISH
通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合 (直接法)，在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜 色标记，同时检测多种染色体异常。
多色FISH
4.FIBER FISH
将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维， 然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后 用荧光显微镜观察结果并分析.
包含了PCR和FISH二种方法的特点，在染色体重排方面可 选择性的代替FISH技术，在使用PRINS技术时,用简单的寡 核苷酸引物代替探针，原位标记染色体，消除了制备DNA 探针困难的问题。
FISH法检测石蜡miRNA总结(共25张PPT)
1、FISH 和细胞免疫化学技术结合，可以同时用多种不同 颜色标记不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细 胞内同时找到基因的位点，转录和翻译的产物，有助了 解核苷酸结构功能以及与蛋白质表达之间的关系。
2、FISH 技术和 RFLE （ RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM ）结合，可以精确地描述染色体长， 短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。 在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较 精确地确定下来。
（2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。
（3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。
（4）梯度(70%、90%、100%)酒精脱水（-20℃预冷），空气中干 燥。
变性
（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液； （2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； （3）78℃孵育8 min；
（10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体（抗地高辛 单克隆抗体）或FITC卵白素，室温下孵育20 min；
（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS 室温下洗3次，每次2 min。
杂交
方法敏感，敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。 （1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；
放（射2 性）原（20位×杂S1S交2C方）（法p，H从7用. 特1殊×的荧PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
荧光显微镜观察FISH结果
（13）每张切片滴30~60 μl -卵白素抗体 抗 ，加塑料盖膜，室 1×PBS室温下洗3次，每次2 min。
在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。
2、FISH 技术和 RFLE （ RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM ）结合，可以精确地描述染色体长， 短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。 在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较 精确地确定下来。
（2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。
（3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。
（4）梯度(70%、90%、100%)酒精脱水（-20℃预冷），空气中干 燥。
变性
（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液； （2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； （3）78℃孵育8 min；
（10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体（抗地高辛 单克隆抗体）或FITC卵白素，室温下孵育20 min；
（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS 室温下洗3次，每次2 min。
杂交
方法敏感，敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。 （1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；
放（射2 性）原（20位×杂S1S交2C方）（法p，H从7用. 特1殊×的荧PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
荧光显微镜观察FISH结果
（13）每张切片滴30~60 μl -卵白素抗体 抗 ，加塑料盖膜，室 1×PBS室温下洗3次，每次2 min。
在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。
荧光原位杂交
探针的非放射性标记
第四军医大学
间接标记：是采用生物素标记DNA探针，杂交 后再用联有荧光素的抗生物素抗体检测。（可 将检测信号放大，监测到小至５00 bｐ的靶序 列）
直接标记：是通过荧光素直接与探针核苷酸或 磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记 探针时掺入荧光素核苷三磷酸标记探针。（检 测步骤简单，但不能将信号放大，不如间接标 记的探针灵敏）
种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可
以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
Applications of FISH
第四军医大学
➢ 基因组结构研究； ➢ 染色体精细结构变异分析； ➢ 病毒感染分析； ➢ 人类产前诊断； ➢ 肿瘤遗传学；
基因组结构研究
第四军医大学
第四军医大学
第四军医大学
探针制备
所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其他标记物（如酶与荧光素等）标记的与 目的基因互补的 DNA 片段或单链 DNA 或 RNA。根据其来源可分为“cDNA探针、基因组探 针、寡核苷酸探针与 RNA 探针”。 1.“cDNA探针” 以 mRNA 为模板——在逆转录酶的催化下合成一条与 mRNA 互补的DNA链 （cDNA）——用碱除去mRNA
荧光原位杂交（FISH）
Fluorescence in situ hybridization
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FISH原理
以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA 变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下 退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光 显微镜观察杂交信号。
第四军医大学
FISH技术的优点
FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点：
荧光原位杂交(FISH)_ppt课件
肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
荧光原位杂交(FISH)技术.ppt
__ 第二天丢弃洗液
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
需要的主要设备
荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上
的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发 出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子， 荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较 长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其 靶标结合后 – 将能检测到荧光信号
水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或 者只需1台FISH杂交仪）。
将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。
将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。
PBS洗，后固定液固定10分钟，PBS洗，晾干后70%的酒精1 min，85%的酒精1 min，100%的酒精1 min 酒精梯度脱水 。
实验程序3 变性杂交
玻片变性，73±1 ℃ 5mins 。关键步骤！！ 20 ℃ 冷冻的70%的酒精1 min85%的酒精1 min100% 的酒精1 min 酒精梯度脱水 。在45-50 ℃热台上使 玻片完全干燥 。---保持DNA单链状态。
二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数
识别和确定染色体易位
单个位点或基因的缺失/扩增
中期分裂相染色体涂片识别某染色体
FISH技术优点
标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂
球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。
客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
需要的主要设备
荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上
的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发 出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子， 荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较 长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其 靶标结合后 – 将能检测到荧光信号
水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或 者只需1台FISH杂交仪）。
将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。
将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。
PBS洗，后固定液固定10分钟，PBS洗，晾干后70%的酒精1 min，85%的酒精1 min，100%的酒精1 min 酒精梯度脱水 。
实验程序3 变性杂交
玻片变性，73±1 ℃ 5mins 。关键步骤！！ 20 ℃ 冷冻的70%的酒精1 min85%的酒精1 min100% 的酒精1 min 酒精梯度脱水 。在45-50 ℃热台上使 玻片完全干燥 。---保持DNA单链状态。
二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数
识别和确定染色体易位
单个位点或基因的缺失/扩增
中期分裂相染色体涂片识别某染色体
FISH技术优点
标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂
球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。
客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性
荧光原位杂交(FISH)技术.ppt
CEP 18 CEP X CEP Y
LSI 21 LSI 13
产前诊断异常核型
羊水标本，未培养，XY, +18。
CEP 18 CEP X CEP Y
LSI 21 LSI 13
24色染色体涂染
比较基因组杂交(Comparative genomic hybridiation,CGH)
比较基因 组杂交 (CGH)
实验程序5 显微镜下观察
选择杂交最好的区域来观察结果 1. 用25X 的物镜扫描整个杂交区域 2. 选择分散较好的区域间期细胞重叠较少或
者分裂相较多的区域观察 3. 用40X 或者 100X物镜 开始从左到右从上到
下计数分析. 4. 计数50个细胞核。 5. 当出现10 – 60% 的嵌和体时，需要计数200
FISH杂交仪
荧光显微镜
光源
滤光片： 一定波长 的光能通 过，其余 波长的光 滤掉，保 证只有需 要的荧光 被激发。
实验程序
样品染色体DNA变性 探针变性 杂交过夜 洗涤复染 显微观察
实验程序1 样本 收集
__AneuVysion kit主要用于培养后的以及未经培养的羊水 __样本必须按照ACT手册的推荐的方法收集 __样本收集必须要保证最小程度的母体细胞污染 __羊水最小需要量为2-5ml,这个依赖与孕周龄 __从收集羊水细胞到培养之间的间隔尽量要短（最晚
__ 第二天丢弃洗液
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
荧光原位杂交FISH
**用于FISH的探针 1）单拷贝探针： （1）种类：酵母人工染色体（ YAC），细菌人工 染色体 （BAC）， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。
**同位素原位杂交的不足： 1）不稳定； 2）高背景； 3）曝光时间长； 4）结果统计学处理繁琐。 5）同位素的使用和处理
1.具有R带带型的正常女性染色体，箭头示杂交 颗粒集中分布于Xp1 1---c1lI 区
2.杂交后R显带的46，Xdic(X)核型，在迟复制的X染色体上有2处被杂交， 为双着丝粒X染色体（小箭头），正常X染色体亦被杂交（大箭头）
第一天（星期一）采血、接种（10:00） 第二天（星期二）培养 第三天（星期三）培养 第四天（星期四）上午7:00 加秋水仙素,(终浓度 0.2ug/ml） 至上午10:00结束培养 制片，不染色，在显微镜下挑选分散良好的标本。 将选好的标本放入50 ℃烤片。
第五天（星期五） 探针变性：75℃水浴5分钟，立即置于0℃ （冰浴中） 5-10分钟。 玻片标本变性： 1. 50℃温箱中2小时 2. 标本在70-75℃，70%甲酰胺/2XSSC中变性 2-3分 钟。 3. 立即脱水，70-90-100%顺序，各5分钟。 4 .室温干燥
同理，采用三种或三种以上不同 的半抗原，如Biotin, DIG和DNP等 标记探针，然后用多种不同颜色的 荧光素，如FITC（绿色）， Rhodamine(红色)，AMA或Cascade Blue(兰色)等结合抗体进行检测， 可同时得到多种不同颜色的荧光信 号，如采用不同的排列组合，最多 可同时检测7种不同的探针。
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FISH, M-FISH probes) 两种以上不同的非同位素标记，不同的 荧光检测系统，通过不同的滤光片组合 或极少数几种非同位素标记探针后，按 照不同的比例混合，可以显示多种颜色。
荧光原位杂交
多色复合染色体FISH探针
荧光原位杂交
探针及标本的变性
1）探针变性 • 将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。
荧光原位杂交
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每 次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的 不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外， 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数 上的误 差等。
• 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 ➢ 间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联
有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以 利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放 大，从而可以检测500bp的片段。 ➢ 直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架 共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能 进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
荧光原位杂交
FISH的原理 FISH的操作及应用 FISH的展望
荧光原位杂交
FISH的原理
• FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针， 按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸 进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由 于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排 列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特 定的基因在染色体上定位。
荧光原位杂交
• FISH技术包括下列几个步骤：
• 1）探针的制备和标记 • 2）探针及标本变性 • 3）杂交 • 4）洗脱 • 5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） • 6）封片 • 7）荧光显微镜观察FISH结果
荧光原位杂交
探针的制备和标记
• 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。 其长度介于15至数千个核苷酸之间，但以250~650个核 苷酸杂交效果最好
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1)
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 简单重复序列探针(simple repetitive probes) ——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)
染色体的着丝粒
异染色质区域
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 间期细胞遗传学的意义： 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一， 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细 胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相， 间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而 且快速。
荧光原位杂交
• 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) • 荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上
发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素 标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧 光染料.
5～10min，使双链DNA探针变性。 2）标本变性 • ①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片
2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中 退色后再烤片）。 • ②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70 ％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 • ③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90 ％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然 后空气干燥。
• 与之比FISH的优点 • ①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 • ②方法敏感,能迅速得到结果 • ③在同一标本上,可同时检测几种不同探针. • ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,
而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA 探针时效率明显下降。
荧光原位杂交
染色体涂染探针
• 染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针
探针来源： （1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent) 体细胞杂种组织融合的产物； （2）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆 /PCR扩增； （3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增； • 应用 （1）染色体数目和结构异常分析；
荧光原位杂交
单拷贝探针：
（1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段
（2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。
荧光原位杂交
单拷贝探针
段的染色体定位
荧光原位杂交
（2）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
荧光原位杂交
染色体涂染探针
人类染色体结构分析
荧光原位杂交
染色体涂染探针：染色体结构异常分
析
荧光原位杂交
多色复合染色体 FISH探针
多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex
• 其靶序列为α卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和 异染色质区域，重复数百次至数千次。 特点：信号强 应用：(a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断
荧光原位杂交
简单重复序列探针
荧光原位杂交
多色复合染色体FISH探针
荧光原位杂交
探针及标本的变性
1）探针变性 • 将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。
荧光原位杂交
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每 次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的 不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外， 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数 上的误 差等。
• 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 ➢ 间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联
有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以 利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放 大，从而可以检测500bp的片段。 ➢ 直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架 共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能 进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
荧光原位杂交
FISH的原理 FISH的操作及应用 FISH的展望
荧光原位杂交
FISH的原理
• FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针， 按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸 进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由 于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排 列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特 定的基因在染色体上定位。
荧光原位杂交
• FISH技术包括下列几个步骤：
• 1）探针的制备和标记 • 2）探针及标本变性 • 3）杂交 • 4）洗脱 • 5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） • 6）封片 • 7）荧光显微镜观察FISH结果
荧光原位杂交
探针的制备和标记
• 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。 其长度介于15至数千个核苷酸之间，但以250~650个核 苷酸杂交效果最好
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1)
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 简单重复序列探针(simple repetitive probes) ——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)
染色体的着丝粒
异染色质区域
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 间期细胞遗传学的意义： 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一， 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细 胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相， 间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而 且快速。
荧光原位杂交
• 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) • 荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上
发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素 标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧 光染料.
5～10min，使双链DNA探针变性。 2）标本变性 • ①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片
2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中 退色后再烤片）。 • ②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70 ％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 • ③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90 ％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然 后空气干燥。
• 与之比FISH的优点 • ①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 • ②方法敏感,能迅速得到结果 • ③在同一标本上,可同时检测几种不同探针. • ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,
而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA 探针时效率明显下降。
荧光原位杂交
染色体涂染探针
• 染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针
探针来源： （1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent) 体细胞杂种组织融合的产物； （2）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆 /PCR扩增； （3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增； • 应用 （1）染色体数目和结构异常分析；
荧光原位杂交
单拷贝探针：
（1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段
（2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。
荧光原位杂交
单拷贝探针
段的染色体定位
荧光原位杂交
（2）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
荧光原位杂交
染色体涂染探针
人类染色体结构分析
荧光原位杂交
染色体涂染探针：染色体结构异常分
析
荧光原位杂交
多色复合染色体 FISH探针
多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex
• 其靶序列为α卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和 异染色质区域，重复数百次至数千次。 特点：信号强 应用：(a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断
荧光原位杂交
简单重复序列探针