基因工程项目药物研发的基本过程

基因工程药物研发的差不多过程

基因工程药物的研发分为上游和下游两个时期：

上游时期：要紧是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最要紧的确实是目的基因的表达。选择基因表达系统要紧考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。现在期的工作要紧在实验室内完成。

下游时期：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量操纵。现在期是将实验室的成果产业化、商品化，要紧包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化操纵，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化操纵等。

血管抑制素(angiostatin ,简称AGN) 是纤溶酶原

的一个酶解片段,相当于其1～4 Kringle 区,具有抑

制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿

瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑

制因子[1 , 2 ] ,关于操纵肿瘤、糖尿病视网膜病变、消

化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研

究价值和应用前景.

PCR产物的T载体克隆

（一）重组T质粒的构建

一．原理

外源DNA与载体分子的连接确实是DNA重组，如此重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分不经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP

形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，因此切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。关于单酶切来讲，载体与供体的末端都相同，连接能够在任何末端之间进行，如此就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，因此除磷后载体可不能自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自

环造成的高本底。关于双酶切来讲，不管载体与供体同一片段上都有不同的末端，如此就幸免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。然而在那个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），如此既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR

产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，能够与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

二．材料与方法

1 材料

外源DNA片断

2 仪器、用具

移液枪、碎冰

3 试剂

pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP

4 方法

连接体系如下：

16℃连接过夜。

（二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定

1 材料

E.coli JM109菌株

2 仪器、用具

超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器

3 试剂

(1) CaCl2、LB平板（见附录）；SOC培养基（见附录）；SOB培养基

(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；无水乙醇的Buffer W2a

(3) 1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6×加样缓冲液

(4) 酚；氯仿；异戊醇

(5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶

4 方法

1. 大肠杆菌感受态细胞的制备

(1) 取大肠杆菌JM109保存液50μl，接种于4ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl 转接到新的4ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管

中，冰浴10min。

(2) 4℃，5000rpm离心2min，去上清液。

(3) 加入750μl预冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min。

(4) 4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。

(5) 加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。

2. 重组DNA的转化

(1) 将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。

(2) 于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，冰浴30min。

(3) 将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。

(4) 在离心管中加入SOC培养基300μl，枪头混匀，37℃、150rpm 和气摇振60min。

(5) 将200μl 转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，选择白色菌落进行鉴定。

注意事项：

①制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。