白血病小鼠造血干细胞移植模型的研究进展

文章编号（Article ID）：1009－2137（2012）03－0788－04·综述·白血病小鼠造血干细胞移植模型的研究进展
路钰夏，唐晓文*，陈广华
苏州大学附属第一医院血液科，江苏省血液研究所，卫生部血栓与止血
重点实验室，江苏苏州215006
摘要小鼠造血干细胞移植模型是进行白血病治疗实验研究的关键，现已广泛应用于抗癌药物筛选、白血病发病机制以及实验性治疗研究等。

小鼠造血干细胞移植模型具有建立周期短，重复性好，使用的肿瘤细胞株生物特性较稳定等优点。

本文将从白血病及肿瘤细胞株的来源、小鼠种属的选择、移植模型的构建及GVHD模型新进展等方面对小鼠造血干细胞移植模型进行综述。

关键词白血病；小鼠移植模型；GVHD
中图分类号R733．7；R-332文献标识码A
Research Advances of Leukemia Mouse Hematopoietic Stem Cell Transplantation Model———Review
LU Yu-Xia，TANG Xiao-Wen*，CHEN Guang-Hua
Departmant of Hematology，First Affiliated Hospital of Soochow Univesity，Jiangsu Institute of Hematology，Key Laboratory of Thrombosis and Hemostasis of Ministry of Health，Suzhou215006，Jiangsu Province，China
*Corresponding Author：TANG Xiao-Wen，Associate Professor，Senior Physician．Tel：（0512）67781850．E-mail：xwtang1020@163．com；
Abstract Mouse model of leukemia hematopoietic stem cell transplantation is the key platform to study leukemia experimental treatment，which has been widely used in anticancer drug screening and in the studies of leukemia pathogenesis and experimental treatment．Transplantation mouse model has several advantages such as short cycle of model establishment，good repetitiveness，and the more stable biological characteristics of the tumor cell lines．The source of leukemia and tumor cell lines，choice of mouse species，the establishment of transplantation model，the recent advances of GVHD model and other aspects of transplantation mouse model are summarized in this review．
Key words leukemia；transplantation mouse model；graft-versus-host disease
J Exp Hematol2012；19（3）：788－791
20世纪50年代早期，在进行放射对小鼠影响的研究中，人们受启发而开始开展造血干细胞移植［1］。

目前，造血干细胞移植已成为治疗恶性血液病的最有效措施之一。

动物造血系统特点与人类极为相似，所以动物移植模型的研发一直是人类白血病实验研究中的热点，并且已成为研究人类白血病病因学、发病机制、生化免疫特征、病理生理改变、细胞和分子生物学特性及实验性治疗的强有力工具，其中小鼠因体型小、费用少等特点而被选作白血病研究的理想实验动物。

随着人类对白血病认识的不断深入，以及白血病实验研究的快速发展和一些新技术的运用，小鼠移植模型的相关研究已经取得了突破性进展。

小鼠移植模型的分类
根据供受鼠之间的种属关系，小鼠移植模型主要分为两大类：同种异体造血干细胞移植和异种造血干细胞移植。

前者又可分为同基因移植和异基因移植，是指将一种小鼠的白血病组织、血液、或白血病瘤株植入同种小鼠体内，导致受鼠发生白血病，然后将同种正常小鼠的造血干细胞植入受鼠体内，如小鼠→小鼠。

后者是指将一种小鼠的白血病组织、血液、或白血病瘤株植入同种小鼠体内，导致受鼠发生白血病，然后将另一种正常鼠类的造血干细胞植入受鼠体内，如大鼠→小鼠。

小鼠移植模型的构建
构建模型的白血病及肿瘤细胞株来源
化学致癌剂诱发许多化学物质，如苯及其衍生物，
*通讯作者：唐晓文，副教授，主任医师，硕士生导师．电话：（0512）67781850．E-mail：xwtang1020@163．com；
2011－12－07收稿；2011－12－26接受
·
887
·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2012；20（3）：788－791
多环碳氢化合物，亚硝胺类物质，保泰松及其衍生物、氯霉素，某些抗肿瘤的细胞毒药物如氮芥、环磷酰胺、甲基苄肼、VP16、VM26等，都公认为有致白血病作用。

丁顺利等［2］利用7，12-二甲基苯蒽诱发BALB/c小鼠产生红白血病，建立了EL961l红白血病的小鼠红白血病模型。

放射、辐射诱发Itoh等［3］用放射线诱发C3H小鼠建立了可移植性红白血病模型。

此外，小鼠粒细胞白血病L801，就是来源于60Co-γ线照射LACA雄性小鼠后诱发粒细胞白血病，然后取其脾细胞悬液注入同系小鼠尾静脉后所建立的瘤株。

病毒诱发我国用津638病毒诱发小鼠产生了网织细胞型T淋巴细胞白血病细胞株L615。

1957年Friend等将埃列希肿瘤小鼠腹水细胞的无细胞滤液注射至Swiss幼鼠，从其脾脏中分离得到的可连续在成鼠体内传代的红白血病细胞株FBL3，随后证实为Friend病毒诱发的红白血病细胞。

自发产生AKR小鼠出生后一年半内，白血病的发生率甚至高于90%，多为胸腺来源的淋巴细胞白血病。

转基因产生从pCC20质粒经酶切分离得到PLZF-RARA融合基因，因pBLUESK多克隆位点EcorⅠ两侧存在ClaⅠ/NotⅠ位点，故先将PLZF-RARA/EcorⅠ位点经KpnⅠ鉴定方向获得pCC23质粒，然后从pCC23经ClaⅠ和NotⅠ酶切获得PLZF-RARA/ClaⅠ/NotⅠ，与经同样酶切线性化的phCG载体连接，转化，筛选获得pCC68质粒，经Sal Ⅰ和PvuⅠ酶切获得hCG-PLZF-RARA转基因构件。

经显微注射法获得G0代转基因小鼠，经一段时间后即发生白血病［4］。

基因敲除产生指利用外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，使之整合到预定位点，并替代原有基因，从而改变细胞遗传性的方法。

例如，通过胚胎干细胞打靶技术建立的ATM （A-T突变基因）白血病淋巴瘤动物模型［5］。

构建模型常用的小鼠白血病细胞株
用于移植模型的白血病细胞株有两类：一类是鼠源性的，常用的有淋巴细胞白血病细胞株L1210、P388、L615、L7212、P1534等［6，7］；红白血病细胞株EL9611、MEL、Friend病毒白血病细胞株FBL3［8］；单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264．7［9］；此外，还有粒-单核细胞白血病细胞株WEHI-3，淋巴细胞白血病细胞株L5178Y等［6］。

另一类是人源性的，应用较少，目前较常用的有淋巴细胞白血病细胞株Jurkat，TALL104，HPB-ALL［10－12］；红白血病细胞株K562［8］；巨核细胞白血病细胞株M-07e等［6］。

构建模型的小鼠种属
小鼠的主要组织相容性复合体（major histocompa-tibility complex，MHC）称H-2复合体，位于第17号染色体，长约1500kb，包括K、I、S、L、D等几个亚区，分为3类，Ⅰ类基因：包括H-2K、H-2D、H-2L 等，分布于复合体的两侧，基因产物主要参与急性排斥，并向CD8+T细胞提呈抗原；Ⅱ类基因：包括Ⅰ-A和Ⅰ-E，基因产物主要参与慢性排斥，并向CD4+ T细胞提呈抗原；Ⅲ类基因：包括C4、C2、Bf基因，基因产物为补体成分C4、C2、Bf。

MHC是移植物不相容的主要决定者，所以供受鼠MHC相合度是决定移植成败的关键。

通常选用体重为18－22g，周龄为6－12周的小鼠作为实验小鼠，而且供鼠常用雄性小鼠，以便于受鼠体内Y染色体的检测；雌性小鼠性格较温和，尾静脉注射容易进行，故常用作受鼠。

用于构建移植模型的实验小鼠有很多种，常用的有C57BL/6（H-2b），BALB/c（H-2d），CB6F1（H-2d/b，C57BL/6ˑBALB/c的子一代），DBA2（H-2d），BCR/ABL融合基因转基因小鼠、TEL-JAK2融合基因转基因小鼠等。

实验研究常用供受鼠组合［13－15］：①同基因移植模型：供受鼠均为C57BL/6（H-2b），雌雄各半；供受鼠均为BALB/c（H-2d），雌雄各半。

②MHC相合移植模型：供鼠为DBA2（H-2d），受鼠为BALB/c（H-2d）。

③MHC半相合移植模型：供鼠C57BL/6（H-2b）和受鼠CB6F1（H-2d/b）；供鼠BALB/c（H-2d）和受鼠CB6F1（H-2d/b）；供鼠CB6F1（H-2d/b）和受鼠BALB/c（H-2d）。

④MHC不相合移植（完全异基因移植）模型：供鼠BALB/c（H-2d）和受鼠C57BL/6（H-2b）。

小鼠移植模型的构建
建立白血病模型预处理前或预处理后（因实验目的而定），将白血病细胞株用PBS缓冲液或RPMI 1640培养液调整为所需密度，经尾静脉回输给受鼠，一般为每只1ˑ103－1ˑ108不等［16］（具体由细胞株来源及恶性程度而定）。

预处理目前常用预处理方案有：直线加速器X射线或60Coγ射线大剂量全身照射（total-body irra-diation，TBI）；免疫抑制剂联合TBI，如环磷酰胺（Cy）联合TBI等；免疫抑制剂单用或联用，如单用Cy，白消安（Bu）联合Cy；全身淋巴结照射（total lymphoid irradiation，TLI）。

其中最常用的是TBI，
·
987
·
白血病小鼠移植模型的研究进展
其主要作用一是作为一种免疫抑制手段避免排斥反应，二是杀灭白血病细胞，三是为干细胞移植排空骨髓空间。

TBI剂量率一般为0．5Gy/min，总剂量因受鼠耐受性而不同，通常为8－12Gy不等，例如，BALB/c（H-2d）耐受性最差，总剂量要低，为8－8．5 Gy；C57BL/6（H-2b）耐受性尚好，总剂量为9．5－10 Gy；CB6F1（H-2d/b）耐受性最好，总剂量可稍大一些，为11．5－12Gy。

制备骨髓细胞悬液颈椎脱臼处死受鼠，在75%乙醇中浸泡5－10min后，无菌操作取股骨、胫骨及肱骨骨髓，制成骨髓单个核细胞（BMMNC）悬液；最后用PBS缓冲液或RPMI1640培养液调整为所需密度，一般为每只（2－10）ˑ106。

回输TBI后4－6h内，最迟延长至TBI后24h内经尾静脉将BMMNC悬液回输给受鼠。

小鼠移植物抗宿主病（GVHD）模型的进展
小鼠GVHD模型制备的意义及方法
同种异基因造血干细胞移植（allo geneic hematopo-ietic stem cell transplantation，allo-HSCT）已成为治疗恶性血液病及某些实体瘤的有效方法，它依靠移植物抗白血病（GVL）效应来清除残存白血病细胞，从而使患者长期无病存活，然而严重的移植相关并发症GVHD限制了这一治疗方法的广泛应用［17］。

因此，如何有效地防治GVHD，同时保留GVL效应依然是allo-HSCT领域亟待解决的难题，这一难题首先必须通过建立稳定的动物GVHD模型后，才能探索相应的解决策略。

早在1966年，Billingham就提出GVHD发生的3个条件：①移植物中必须有足够的免疫活性细胞；
②受者必须表达不同于供者的抗原；③受者无法发挥对移植物的有效排斥反应。

但小鼠骨髓中淋巴细胞含量低（3%左右），单纯骨髓移植不易引起GVHD。

1997年Speiser等［18］以C57BL/6为供鼠、BALB/c为受鼠建立了小鼠allo-HSCT后GVHD模型，并发现在供鼠骨髓细胞中混入脾细胞可以增强GVHD程度。

经过长期实验研究证实，当移植物中脾细胞大于107/只时，方可造成典型的GVHD症象。

随着小鼠GVHD模型的建立渐趋成熟，近年来针对GVHD的预防及治疗的动物实验研究正普遍开展。

有文献报道［17］，在allo-HSCT时，联合输注供者CD4+CD25+T细胞（Treg）可减少及减轻GVHD，同时又保留GVL效应。

移植前供鼠或受鼠使用他汀类药物后，受鼠体内Treg细胞数也会显著增加，从而使受鼠GVHD减少及减轻，同时GVL效应未受任何影响［19］。

还有研究显示［20］，骨髓间充质干细胞（BMMSC）能够抑制allo-HSCT后aGVHD的发生，同时又具有一定的GVL效应。

还有文献报道［21］，allo-HSCT后IL-21受体缺陷的受鼠GVHD较正常受鼠减轻，同时生存期也较正常受鼠延长，该研究表明，IL-21在GVHD中起关键作用，通过抑制IL-21的功能可能会减轻GVHD，同时延长受者生存期。

这些实验结果为小鼠allo-HSCT 后GVHD的治疗及预防提供了新的方法，同时也为allo-HSCT在临床的更广泛应用提供了可能。

小鼠GVHD模型的优缺点
小鼠GVHD模型用于白血病的实验研究有许多优势：①建模使用的白血病细胞株种类多，在世界范围内分布广泛，而且这些细胞株的生物学特性已经比较明确，一般都有明确的背景资料，使一群动物同时接种同样数量的瘤细胞，生长速率较一致，个体差异较小，成活率接近100%，便于客观对照评价；②白血病细胞株可以在同种或同系动物体内或体外培养传代，长期保存，以供连续或重复试验研究之用；③近交系小鼠的培育和普遍使用，以及使用各种化学致癌剂对实验小鼠诱发肿瘤方法的建立，为建立小鼠GVHD模型提供了更大方便。

但是，小鼠GVHD 模型目前也存在不足之处：①与人体肿瘤细胞相比，使用的白血病细胞株增殖速度快，体积倍增时间短，对恶性血液病的临床治疗研究有一定的限制性，许多国家筛选抗癌药物时选用的移植瘤株经常改变，主要原因可能也与此有关；②某些被广泛使用的白血病细胞株经体内、外培养传代，随着时间的推移，细胞株的某些生物学特性可能已经发生变化，这些变化对于实验的准确性和可比性将产生不利影响；
③移植后某些种鼠生存期不稳定，对于转基因动物，还会存在基因不稳定等问题。

结语
小鼠移植模型因建立周期短、重复性好、使用的肿瘤细胞株生物特性较稳定等优点，已经成为目前国内外常用的白血病动物移植模型复制方法之一；同时近交系小鼠的培育和普遍使用，以及各种实验技术的不断完善，也为复制动物模型提供了极大方便。

为了控制allo-HSCT后GVHD，同时保留GVL效
·
097
·中国实验血液学杂志J Exp Hematol2012；20（3）
应，近年来小鼠GVHD模型的相关研究也正在积极开展，并且取得了突破性进展，这些都为白血病的临床治疗奠定了实验基础。

当然，白血病小鼠移植模型目前仍存在一些问题，如有些细胞株可能在传代过程中已经发生变异，转基因动物还会存在基因不稳定等。

但是，随着研究的进一步深入，人们将会建立更为完善的白血病小鼠移植模型，在治疗和研究白血病方面取得更大的突破。

参考文献
1Reddy P，Negrin R，Hill GR．Mouse models of bone marrow transplantation．Biol Blood Marrow Transplant，2008；14（1）：129－135
2丁顺利，褚建新，赵钧铭，等．可移植Blab/c小鼠红白血病模型的建立及其生物学特性．中华血液学杂志，1998；19（12）：638－641 3Itoh K，Ono K，Sawada H，et al．Establishment and characteriza-tion of a transplantable erythroblastic leukemia in C3H mice．Leuk Res，1988；12（6）：471－478
4孟秀琴，成国祥，王龙．hCG-PLZF-RARA转基因小鼠发生慢性粒细胞样白血病．中华肿瘤杂志，2000；22（1）：22－25
5Khanna KK．Cancer risk and the ATM gene：a continuing debate．J Natl Cancer Inst，2000；92（10）：795－802
6McCormack E，Bruserud Q，Gjertsen BT．Animal model of acute myelogenous leukemia-development，application and future perspec-tives．Leukemia，2005；19（5）：687－706
7李湘新，陈学良，马道新，等．树突细胞应用于荷白血病小鼠免疫治疗的实验研究．中华血液学杂志，2006；27（2）：73－77
8王春艳，谭获，郭坤元．供体NK细胞在白血病小鼠半相合骨髓移植中的作用．中华血液学杂志，2009；30（2）：107－110
9Fu JF，Hsu CL，Shih LY．MLL/AF10（OM-LZ）-immortalized cells expressed cytokines and induced host cell proliferation in a mouse bone marrow transplantation model．Int J Cancer，2010；126（7）：1621－1629
10Introna M，Franceschetti M，Ciocca A，et al．Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells：an
innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation．Bone Marrow Transplant，2006；38（9）：621－627
11Huang B，Sikorski R，Sampath P，et al．Modulation of NKG2D-ligand cell surface expression enhances immune cell therapy of cancer．J Immunother，2011；34（3）：289－296
12Masuda S，Kumano K，Suzuki T，et al．Dual antitumour mecha-nisms of Notch signaling inhibitor in a T-cell acute lymphoblastic leukemia xenograft model．Cancer Sci，2009；100（12）：2444－2450
13吴远彬，周健，郭坤元，等．移植性C57BL/6小鼠FBL-3红白血病模型的建立及其生物学特性．肿瘤基础与临床，2010；23（3）：192－194
14Uckun FM，Roers BA，Waurzyniak B，et al．Janus kinase3 inhibitor WH1-P131/JANEX-1prevents graft-versus-host disease but spares the graft-versus-leukemia function of the bone marrow allografts in a murine bone marrow transplantation model．Blood，2002；99（11）：4192－4199
15Li A，Jiang J，Zhang Q，et al．Cytokines transduced bone marrow stromal cell lines promote immunohematopoietic reconstitution in mice after allogeneic bone marrow transplantation．Immunol Lett，2005；98（2）：216－224
16陈广华，吴德沛，孙爱宁，等．IL-2和IL-15激活供者自然杀伤细胞在异基因造血干细胞移植应用的实验研究．中华血液学杂志，2008；29（8）：526－530
17曹将，陈翀，曾令宇，等．供体Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和GVL效应的影响．中国实验血液学杂志，2010；18（1）：181－184
18Speiser DE，Bachmann MF，Shahinian A，et al．Acute graft-versus-host disease without costimulation via CD28．Transplanta-tion，1997；63（7）：1042－1044
19Broady R，Levings MK．Graft-versus-host disease：suppression by statins．Nat Med，2008；14（11）：1155－1156
20胡文兵，高清平，陈友华．骨髓间充质干细胞对异基因骨髓移植后aGVHD和GVL的影响．中国实验血液学杂志，2005；13（3）：404－407
21Meguro A，Ozaki K，Hatanaka K，et al．IL-21is critical for GVHD in a mouse model．Bone Marrow Transplant，2010；45（4）：723－729
·
197
·
白血病小鼠移植模型的研究进展。