生化大实验实验步骤(实验6,7,8)

实验六、质粒酶切及电转化毕赤酵母

一、实验原理及目的

核酸不能自动进入细胞，需要协助才能穿过细胞壁的物理屏障进入能够进行表达或复制的胞内位点。电流可逆性的击穿细胞膜形成瞬时水通路或膜上小孔，促使DNA分子进入胞内。电场强度为kV/ cm、持续时间为μs —ms 级的电脉冲刺激会使细胞膜发生电穿孔现象,即:细胞膜结构重组,出现微孔,电导率改变,暂时丧失屏障功能等,从而引起离子的流出, 代谢物的排泄, 细胞对药剂及DNA 等大分子的吸收量增加。线性DNA分子与环状DNA分子均可用于转染，但线性DNA无论是瞬时表达还是稳定转染的水平高于环状分子。所以对于闭合环状的质粒DNA来说，要首先利用限制性内切酶切割使其变成线性分子，然后进行转染。

同时转染的效率还会以下因素影响：外加电场的强度、电脉冲的长度、温度、培养基的离子成分。

掌握电穿孔转染DNA技术。

二、材料和试剂

RDB培养基 1、取Sorbitol 18.6g 及琼脂 3 g 溶于70ml水中。

2、10Х D 10ml （8g葡萄糖，40mlDDW）X3 灭菌110℃ 15min

10 YNB 10ml （13.4gYNB 100mlDDW 过滤除菌） 500Х B 0.2ml ( 2mg 生物素，10ml水，过滤除菌) 100Х AA 1.0ml （过滤除菌）

DDW 8.8ml

将1、2 两种溶液混合，加热后倒平板，每个平板10ml.共10个平板。

I、线性化质粒的制备

SacI酶切质粒3小时

酶切体系（根据质粒浓度而定，保定质粒浓度DNA大于1μg/μl）

DDW 16.5μl

BufferI 2.5μl

质粒 5μl

SacI 1μl

跑胶回收质粒

II、酵母感受态细胞的制备：

1、按1：100将300μl保种菌接种于3mlYPD培养基中30℃揺菌过夜（约15h）

2、取活化的菌液50μl接入50mlYPD液体培养基30℃揺菌过夜，至OD600

=1.3-1.5（12-15h），收集菌体制备感受态细胞。

3、4℃ 3000g离心5分钟，弃上清，向沉淀加5ml无菌DDW重悬，补加冰预冷

的无菌水至100ml

4、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于15ml冰预冷的无菌水中

5、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于3ml冰预冷的山梨醇中

6、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于0.1ml冰预冷的山梨醇中

7、按照80μl每管分装于1.5mlEP管中，立即使用或于-20℃存放

III、电转化

1、将感受态细胞80μl加入10μl（5-20μg）线性化质粒，混匀，加入到冰

预冷的电转杯中，冰上放置5分钟。

2、设置电转仪于真核细胞程序，电转条件：1.5KV 25μF 200ΩIV、阳性克隆筛选

1、电转成功后，将菌液涂于RDB板上，30℃恒温培养箱培养2-3天，观察克隆生长状况。

各组放自己的平板照片，对不住各位，我忘了拍照。

实验七重组蛋白的表达及western blot 鉴定

表达试剂：10×D 10×YNB 500×B

10×GY： 10ml甘油，90ml水，高压灭菌。

10×M：5ml 甲醇加水至100ml，过滤除菌。

1M磷酸钾缓冲液（ph6.0）:13.2 ml1M K2HPO4,86.8ml 1M KH2PO4,调至PH6.0。

BMGY培养基：4gYE，8gTryptone，280mlDDW，高压灭菌后，超净台中加10×GY，10×YNB，1M磷酸钾缓冲液（ph6.0）各40ml，0.8ml 500×B

BMMY培养基：1gYE，2gTryptone，70mlDDW，高压灭菌后，超净台中加10×M，10×YNB，1M磷酸钾缓冲液（ph6.0）各10ml，0.2ml 500×B

表达步骤：

1 挑取单克隆，接种至含 100ml BMGY 的 1L 隔板摇瓶中。在摇床中

28-30度，250-300rpm 生长至 OD600=2-6(约 16-18 小时)。

2 室温 1500-3000g 离心 5min 收集细胞，去除上清，用 1/5-1/10 原培养基体积的 BMMY 重悬细胞(约 10-20ml)。

3 置于 100ml 隔板摇瓶中，用 2 层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养。

4 每隔 24 小时，加入甲醇至终浓度为 0.5%以继续诱导。

5 在不同的时间点，取 1ml 培养基至 1.5ml 离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。

6 分泌表达时，将上清转移至单独管中，将上清及细胞沉淀存于-80 度直至开始检测。

挑酵母重组子接种于3ml YPD，摇菌过夜（16h），转接于400ml BMGY培养基摇培24h，静置4h左右，倒掉上清，加入100mlBMMY，摇培30h左右，添加1ml

甲醇，24h后再添加1ml甲醇，24h后收菌，12000rpm 离心15min，留上清。western blot 原理

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

所用试剂：

转膜缓冲液：（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）甘氨酸（MW75.07） 2.9g

Tris（MW121.14） 5.8g

SDS 0.37g

甲醇 200ml

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，此溶液可重复使用3～5次（此溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）

TBS缓冲液：（10mM Tris-Hcl pH7.5, 150mmol/L NaCl）

1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml

NaCl 8.8g

蒸馏水至 1000ml

（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

10×TBS: Tris 12.11g ，NaCl 88g

蒸馏水至 900ml，调节pH至7.5，定容1000ml

Tris 4.844g ，NaCl 35.2g 。蒸馏水至 350ml，调节pH至7.5，定容400ml

TBST缓冲液：（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）

20％Tween20 1.65ml

TBS 700ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

封闭液：脱脂奶粉 5g

TBST 100ml

最好现用现配。

或者用含5%BSA的TBST

溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。实验步骤

一．制备凝胶

1.胶模固定：将两块洗净的玻璃板，按要求对齐，夹好。将

胶模装入电泳槽固定好，并将胶模下端封好，

防漏。(电泳槽按要求清洗干净)。

2.制备分离胶：按分离胶配制方法配好分离胶，缓慢注入胶

模中（占玻璃板的2/3），为了防止氧化，沿

玻璃板壁轻轻加一层水层（注意不能将胶冲

起），室温下聚合40min。

3. 制备浓缩胶：配制好5%浓缩胶。将胶模中上层水倾倒出

去，用滤纸吸干余水。倒入浓缩胶插好样品

梳，注意避免汽泡出现。

4. 电泳：将胶模装好，去胶条后，装入电泳槽中，检查是否

漏液后，倒入电泳缓冲液，胶模内侧的液面没过

矮板但不可超过高板（矮板在内）。

5. 上样：将样品梳拔出，用电极级冲液冲洗样品孔。样品与

样品缓冲液按一定比例混合好（蛋白含量大约为1-

2μg/μl）。用微量注射器加人加样孔，加样量为

5～10μl。

6. 电泳:连接直流稳压电源，矮板连负极，打开电源开关。

调节电压，进人分离胶之前为80V，进人分离胶

之后为12OV。

转膜

1.准备6张和凝胶大小相近的滤纸和1张PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

2.甲醇活性化PVDF膜：一般活化5-10min，用镊子捏住膜的一边轻轻置于有甲醇的培养皿里浸泡。

3.转膜液浸泡：将电泳好的凝胶剥下，去掉浓缩胶，切割成合适大小，注意目的条带的位置。在加有转移液的培养皿中放入切好的凝胶、平头镊子、一支玻璃棒、滤纸、浸过的膜。

4.半干法转膜：在转膜液中对齐三层滤纸，用平头镊子赶出滤纸层中的气泡，夹出放在转膜仪上；膜盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒轻轻擀去气泡（由中间向两边赶）。将分离胶盖于膜上，并除气泡。在分离胶上盖3

张滤纸并除去气泡。擀几下就可合起夹子。整个操作要不断的擀去气泡。

5.盖上转膜仪上盖，设置好电压和时间。一般用半干转膜仪15V 45-60min

6转完后将膜用1×丽春红染液染1-2min（平头蘖枝夹住边缘，轻轻浸入染液）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白（超纯水多洗两遍，）。将膜晾干备用。

封闭：将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的培养皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。用TBS将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)。

孵育一抗：一抗用封闭液（或者用含有5%BSA的TBST）稀释至适当浓度（在1.5ml 离心管中）；将PVDF膜放入PE手套中，用封口机将膜封闭，将抗体溶液

加到膜的蛋白面（转膜时做好标记）赶出残留气泡；室温下孵育2h后，

用TBST在室温下脱色摇床上洗3次（多洗几次，多加TBST），每次10min；

再用TBS洗一次， 5min。

孵育二抗：同上方法准备稀释二抗，摇床，室温下孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min；再用TBS洗一次，5min。

一抗推荐稀释比例：1:2000-1:20000

二抗推荐稀释比例：1:5000-1:20000

ECL显色

ECL和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。

ECL灵敏度比DAB高很多。

A组WB结果：

WB无结果可能的原因：

1、蛋白浓度太低

2、抗体不好

3、显色液不好

4、一抗二抗比例不合适

5、一抗二抗没有孵育上

6、转膜转过了

注：这些都是部分可能的原因，仅供参考。你们在实验结果分析的时候，为了得到一个好成绩，尽可能的写的详尽点。

B组结果：

原因：

1，一抗或二抗未洗净

2，一抗失效

3，注：这些都是部分可能的原因，仅供参考。你们在实验结果分析的时候，为了得到一个好成绩，尽可能的写的详尽点。

实验八：镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤，注意事项！！！

1、过柱前的注意事项：

a、样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；

b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；

c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争；

2、过Ni柱的操作步骤：

（1）用10倍去离子水洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni 离子沉淀；

（2）10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；（3）上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）；

（4）20×柱体积的Washing Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20-50mM咪唑，pH8.0）洗涤，至无蛋白检出，收集流出液；

3、柱的清洗与保存：

a、去Ni离子：a、5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤；

b、10×柱体积的去离子水洗涤。

b、去沉淀的蛋白质：a、5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；b、去离子水洗涤，至流出液的pH值为7。

c、保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。