生化大 实验报告

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生化实验报告
1 材料与试剂
1.1源自文库菌种
大肠杆菌工程菌株 BL21(DE3)
1.2 实验试剂
葡聚糖 G-75 干粉、 Tris-HCl、NaCl、标准蛋白、IPTG（异丙基硫代-β-D半乳糖）、starting buffer、8 M/L 尿素、乙醇、咪唑、Marker、PVDF 膜、TBS、 吐温、一抗、酶标二抗，牛血清蛋白，糜蛋白酶、PNPP 等试验试剂。
2 方法与步骤
2.1 装柱及标准样品的分子筛层析
把柱子固定在夹子上，打开下面的盖，用取液器匀速加入介质。保证介质均 匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与 柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。液体接近界面时加入 3ml 超纯水，同时在层析杯中加入 100ml 超纯水，连接泵洗柱 15min，同时配制 平衡液 200mL（20mmol Tris-HCl,pH 8.0; 20mmol NaCl）。待液体接近界面时， 在柱中加入 3ml 平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为 3ml/10min（一分钟约 6-7 滴）。平衡柱过中午。
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1ml 破碎前菌液， 处理后进行 western 及 PAGE，其余放入冰箱于 4 度保存。
2.3 BAP 的亲和层析纯化
2.3.1 盐酸胍破碎 将 100ml 诱导后的菌液分别放于大离心管中，配平，5000rpm 离心 15min。
弃去上清液加入 1/10 体积 PH8.0 磷酸钠缓冲液（20mM）重悬后 5000rpm 离心 10min， 去上清。在沉淀中加入 1/10 体积的 6M 的盐酸胍溶液（注：盐酸胍要用 20mM 的 磷酸钠缓冲液溶解）。用玻动棒搅开后在 30℃的摇床 10min。分装于 1.5ml 离心 管中，12000rpm 离心 10imn，取上清，上样（留 100μl 上样前的蛋白样品）。 2.3.2 超声波破碎
清洗电泳槽，玻璃板，胶条等电泳装置，然后用滤纸轻轻吸水晾干。组装玻 璃板（凹面向外），封胶条要贴紧玻璃板，胶条下端要平直，并且胶条始终要自 然弹性范围不要用力拽。准备一个小烧杯，配制 12%的分离胶，混匀后立即用取 液器加入玻璃板中，加至红线处。再加入 1ml 的超纯水，静置 30min。待胶凝固 后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。配制 5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳 子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃板凹面相平。静置 30min。待浓缩胶凝固后 垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内重新组装，然后向内 外槽加入电极缓冲液。按顺序依次点样，两块胶一块做 SDS 染色（普通 Marker）， 另一块做 western 杂交（点预染 Marker）。Marker 要提前处理。
超声要求 a 将菌液处理至清亮；b 始终保持低温环境；c 避免出现黑色沉淀。 将超声处理后的样品于 4℃ 2000rpm 离心 10min，沉淀为细胞碎片弃去。上清再 于 4℃ 12000rpm 离心 10min。上清为可溶性蛋白，沉淀为包涵体。（包涵体留样 1ml，可溶性蛋白留样 100μl）。
2.4 上亲和柱
每柱中装 1.5ml 的介质、乙醇混合液（混合后加）。打开底下的帽，待液体 滴至界面时加入 5 柱体积约 4ml 的超纯水洗 5 遍，然后加入 5 柱体积的 storting buffer，5 遍平衡柱。待液体接近界面时，用取液器将可溶性蛋白样品加入亲和 柱。（盐酸胍破碎）。可少上一些样品，根据流速确定上样量。超声波破碎的要全 部上样。并且根据流速可以上 2-3 次。待样品流到界面时，用含 10mM 咪唑的淋 洗液洗 10 柱体积。（注意：咪唑用破碎缓冲液稀释）。用 3ml 含有 300mM 咪唑的 洗脱液洗脱，并且用 eppendorf 管收集每管 500μl。（留样 100μl）其余的洗脱 样品用于离子交换层析。
将电泳装置与电泳电源连接（注意正负极）。调电压 60V。待溴酚蓝前沿进
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入分离胶后，换成 90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停 止电泳。 2.6.4 电泳胶处理
电泳完毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通 Marker 的胶浸泡在染色液中。染色→脱色→水洗（过夜）。预染 Marker 的胶进 行转膜处理。
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2.5 BAP 的分子筛排阻层析
亲和层析的样品第 2、3、4 管分别取 400µl 混匀于 1.5ml 离心管中上柱，重 力使之渗入柱子。样品接近界面时，加入 1ml 起始缓冲液。打开泵开始收集（加 样时即打开读纸器），在峰顶处留样测定酶活。关读纸机。然后用 20ml 0.1M Nacl 的处理柱子。洗柱，用超纯水洗 30min 左右。
缓慢向柱中加入样品 4ml 打开层析柱上下端，使样品靠重力流出。当样品接 近 界 面 时 在柱 中 加 入 3ml 上 样缓 冲液 （即平 衡液 ），连 接 泵，调 T=100 ， A(0.5A)=0 ,开启记录仪，同时配制 100ml 0.1M Nacl。待两个峰都出来后，把 层析杯中的液体换为 0.1M Nacl 洗柱 20min，再用超纯水洗柱 30min，封柱，关 机。
清洗转移电泳槽等装置。蒸馏水漂洗点有预染 Marker 的胶。然后浸泡在转 移缓冲液中。戴上手套用镊子夹住 PVDF 膜。先在甲醇中精确处理 15 秒。然后放 入蒸馏水槽中漂洗一下，最后放于盛有转移缓冲液的盆中平衡 15min。同时将 4 片滤纸 2 块海绵浸泡在转移缓冲液中。尽量用玻璃棒赶去海绵中的气泡（否则易 短路）。按照阴极黑板—海绵垫—2 层滤纸—凝胶—PVDF 膜—2 层滤纸—海绵垫 —阳极红板的顺序装。80mA 恒流下在转移电泳槽中冰浴电泳 2.5 小时。取出 PVDF 膜放于干燥滤纸上片刻，但不要吸干膜。灭菌去离子水中冲洗。
配 5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃 板凹面相平。静置 30min。 2.6.4 准备及电泳
待浓缩胶凝固后垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内 重新组装，然后向内外槽加入电极缓冲液（内槽一定要加满）。
按顺序依次点样，两块胶一块做 SDS 染色（普通 Marker），另一块做 western 杂交（点预染 Marker）。Marker 要提前处理。
诱导后的菌体置于大离心管中，5000rpm 离心 15min，弃上清。加入 1/10 体积的破碎缓冲液洗涤。离心 15min 5000rpm 去上清，加入破碎缓冲液及终浓度 为 50μl/5ml 的溶菌酶（现用现配，母液 100mg/ml）。 30℃温浴 15min。（离心 时调好 30℃的水浴摇床）。在冰浴条件下，60%功率超声处理 5min（具体做法是 每管中 0.5ml 样品，每五管一组，放于冰浴中连续处理，每管 4 秒，再重复，直 到处理 5min 为止。再用 40%功率超声处理 5min）。
2.6 SDS-PAGE
2.6.1 样品处理 包涵体处理：在留样的沉淀中加入 500μl 8M 的尿素，摇匀。取 20μl 于
1.5ml 离心管中，再加入 50μl 上样缓冲液，于 100℃沸水中煮沸 5min。菌体处 理：将留样的 1ml 菌体于 12000rpm 离心 1min，用滤纸吸干残液，用 100μl 上 样缓冲液重悬菌体，100℃沸水中煮沸 5min。亲和层析样品处理：取亲和层析样 品，2 和 3 号管各 20μl 于 1.5ml 离心管中，再加入 20μl 上样缓冲液，于 100℃ 沸水中煮沸 5min。待样品冷却后 12000rpm 离心 5min。 2.6.2 清洗安装
将 PVDF 膜放入玻璃平皿中加入封闭液（10mlTBS，10ml，0.25g 脱脂奶粉）， 在摇床上封闭 2 小时。取出 PVDF 膜，在 1XTBS 中漂洗 2 次后放入平皿中加入 10ml 一抗封闭液（10ml 1×TBS，5μl 吐温，5μl 一抗，0.5g 奶粉），在脱色摇床上
学号
内蒙古大学生命科学学院生物系 生物化学实验室
生物化学大实验结题报告
论文题目：重组细菌性碱性磷酸酶的分离、 纯化及特性分析
学生姓名： 年 级： 专 业： 指导教师：
2011 年 xx 月 xx 日
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重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析
XX （xxxxxxxxxxxxxxxxxxx(地址)） 摘 要: 将外源基因 BAP 克隆在含有 lac 启动子的表达载体 coli 中，让其在 E. coli 中表达。培养宿主菌，在培养基中加入诱导物 IPTG（异丙基硫代-β-D-半 乳糖），使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，而外源基因大量转录并高效表达。将 宿主菌进行超声波破碎，用亲和层析柱将蛋白分离纯化，最后 SDS-PAGE 检测转 录表达蛋白，用 Western-blotting 方式分析蛋白特性。 关键词：细菌性碱性磷酸酶；亲和层析；SDS-PAGE；Western-blotting 碱性磷酸酶是适于在 pH 约 9-10 的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷 酸游离的磷酸脂酶的总称。它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,是分子生物学 中常用的工具酶之一。它的作用是催化核酸分子脱掉 5’磷酸基团，从而使 DNA(或 RNA)片段的 5'-Pi 末端转换成 5'-OH 末端，这也就是所谓的核酸分子的 脱磷酸作用。而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。碱性磷酸酶有两种来源：一 种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,简称 BAP)；BAP 属于同源二聚体蛋白，分子量为 56KDa。每个单体 由 449 个氨基酸组成，完整的 AKP 分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个 单体均具有一个活性中心，活性中心区域由 Asp101-Ser102-Ala103 三连体、 Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。细菌性碱性磷酸酶是一种 能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除 去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而 该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。其最适 pH 是 8.0。上图为 细菌性碱性磷酸酶二级结构。 实验中使用我们在应用基础研究中建立的表达重组 His-BAP 的大肠杆菌 BL21(DE3) 工 程 菌 株 ， 在 IPTG 的 诱 导 下 表 达 有 活 性 的 重 组 His-BAP 并 通 过 SDS-PAGE 和 Western-blotting 进行鉴定。本实验技术路线：重组蛋白的诱导表 达→重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白的分子筛排阻层析纯化→SDS-PAGE 电泳 及 Western-blot 鉴定重组蛋白→重组蛋白活性的检测。
2.2 BAP 的诱导表达
在 5ml 培养基中加入 Amp 2.5μl（母液为 100mg/ml）和 10μl 菌液。在摇 床上 37℃ 130 转过夜预培养。之后取预培养的菌液 2.5ml，将菌液加入 50ml 含 有 Amp (25μl)的 LB 培 养 基中 以 1:20 的比 例 扩 增。 在 37 ℃恒温 摇 床 ， 以 180-200rpm 培养 40-60min 左右。之后加入终浓度为 1mM 的 IPTG(500μl)进行外 源基因的诱导表达。于室温诱导 4-5 小时。取出诱导细胞进行细胞超声破碎，留
清洗电泳槽，玻璃板（用海绵块洗），胶条等电泳装置，然后用卫生纸轻轻 吸水晾干。组装玻璃板（凹面向外），封胶条，要贴紧玻璃板，胶条下端要平直 并且胶条始终要自然弹性范围不要用力拽。每组装好后让老师检查后再去灌胶。 2.6.3 分离胶及浓缩胶的配置
准备一个小烧杯，按照实验讲义的配方配。12%的分离胶，混匀后立即用取 液器加入玻璃板中，加至红线处。然后加入 1ml 的超纯水。静置 30min。待胶凝 固后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。
将电泳装置与电泳电源连接。调电压 60V。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，换 成 90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停止电泳。电泳完 毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通 Marker 的胶 浸泡在染色液中。染色→脱色→水洗（过夜）。预染 Marker 的胶进行转膜处理。