生化大 实验报告
生化大实验实验报告
生化大实验实验报告姓名：学号：专业：班级：实验班级：单位：指导老师：实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、实验原理：多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。
另外，多酚氧化酶也可以与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。
蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。
二、实验目的：通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。
三、材料与试剂：1.材料：马铃薯（两小组共称200g）2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机；四、操作步骤：1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min；2.用两层纱布将所得的浆液过滤；3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min；4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min；5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min；6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。
生理性生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解细菌生理生化反应原理；2. 掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法；3. 了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。
二、实验原理通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些糖的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物的多样性。
某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应，形成红色的玫瑰吲哚，为吲哚反应阳性。
微生物发酵葡萄糖成丙酮酸，2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性条件下与肌酸类物质反应，生成红色物质，为甲基红反应阳性。
三、实验方法1. 吲哚试验：将细菌接种于含有色氨酸的培养基中，加入吲哚试剂，观察颜色变化。
2. 甲基红试验：将细菌接种于含有葡萄糖的培养基中，加入甲基红试剂，观察颜色变化。
四、实验结果1. 吲哚试验：接种了大肠杆菌的试管在加入乙醚和吲哚试剂后，能在乙醚和液体培养基的交界面上产生红色环状物质，大肠杆菌的吲哚试验显阳性。
2. 甲基红试验：大肠杆菌甲基红试验阳性，即大肠杆菌在培养期仍维持酸性pH。
五、实验分析1. 吲哚试验失败原因分析：可能是因为乙醚加量太少，影响实验现象的观察；另一个可能的原因是大肠杆菌菌种有问题。
2. 甲基红试验结果分析：大肠杆菌在培养后仍能维持酸性，而产气杆菌则转化为非酸性末端产物。
六、实验结论1. 通过本实验，我们了解了细菌生理生化反应原理；2. 掌握了细菌鉴定中常见的生理生化反应方法；3. 认识到生理生化反应在鉴别细菌中的意义。
七、实验注意事项1. 实验过程中要严格按照操作规程进行，避免污染；2. 注意观察实验现象，记录实验数据；3. 分析实验结果，找出实验失败的原因。
第2篇一、实验目的1. 了解生理性生化实验的基本原理和方法。
2. 掌握常用的生理性生化指标及其检测方法。
3. 通过实验，学会使用生理性生化检测仪器，提高实验技能。
二、实验原理生理性生化实验是研究生物体内各种生化反应及其代谢过程的重要手段。
生化实验报告本科
一、实验目的1. 学习和掌握血清中总胆固醇（TC）测定的原理和方法。
2. 培养实验操作技能，提高实验数据的分析能力。
二、实验原理总胆固醇（TC）是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇的总和。
测定血清中TC的含量对于评估个体的血脂水平、预防心血管疾病具有重要意义。
本实验采用酶法测定TC，即通过胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase, COX）将胆固醇氧化为胆汁酸，同时生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶（Peroxidase, POD）的作用下，将邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）氧化成蓝色产物，其颜色深浅与TC含量成正比。
三、实验材料与仪器1. 仪器：酶标仪、恒温水浴锅、微量移液器、离心机等。
2. 试剂：血清样本、胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase, COX）试剂、过氧化物酶（Peroxidase, POD）试剂、邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）试剂、蒸馏水、标准胆固醇溶液等。
3. 试剂规格：胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase, COX）试剂、过氧化物酶（Peroxidase, POD）试剂、邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）试剂均按照说明书配制。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）取6个试管，编号为1-6。
（2）分别加入标准胆固醇溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μl，然后加入蒸馏水至100μl。
（3）在酶标仪上，设置波长为505nm，读取各管吸光度（A）值。
（4）以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定（1）取6个试管，编号为1-6。
（2）分别加入血清样本0.5μl，然后加入蒸馏水至100μl。
（3）按照标准曲线绘制步骤，测定各管吸光度（A）值。
（4）根据标准曲线，计算血清中TC含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制标准曲线如下（以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标）：胆固醇浓度（μmol/L） | 吸光度（A）------------------------|-----------0 | 0.1000.5 | 0.1501.0 | 0.2001.5 | 0.2502.0 | 0.3002.5 | 0.3502. 样品测定血清中TC含量为2.3μmol/L。
生化实验报告书
实验名称：蛋白质变性实验实验日期： 2023年10月25日实验者：张三一、实验目的1. 了解蛋白质变性现象及其影响因素。
2. 掌握蛋白质变性实验的原理和方法。
3. 分析不同条件下蛋白质变性的情况。
二、实验原理蛋白质变性是指蛋白质分子在物理或化学因素作用下，其空间结构发生改变，导致其生物活性丧失的过程。
蛋白质变性受多种因素影响，如温度、pH值、有机溶剂、重金属离子等。
本实验通过观察蛋白质在不同条件下的变性情况，分析蛋白质变性的影响因素。
三、实验材料与仪器材料：1. 牛血清蛋白（BSA）2. 0.1M HCl3. 0.1M NaOH4. 10%硫酸铵5. 95%乙醇6. 0.1M Tris-HCl缓冲液（pH7.4）仪器：1. 电子天平2. 恒温水浴锅3. 移液枪4. 试管5. 试管架6. 移液器7. 紫外可见分光光度计四、实验方法1. 将BSA溶液分别置于不同温度（25℃、50℃、75℃、100℃）的水浴锅中加热5分钟，观察蛋白质变性情况。
2. 将BSA溶液分别置于不同pH值的0.1M HCl和0.1M NaOH溶液中处理5分钟，观察蛋白质变性情况。
3. 将BSA溶液与10%硫酸铵溶液按1:1比例混合，观察蛋白质变性情况。
4. 将BSA溶液与95%乙醇按1:1比例混合，观察蛋白质变性情况。
5. 将蛋白质变性后的溶液用0.1M Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）透析过夜，去除未变性的蛋白质。
6. 使用紫外可见分光光度计测定透析前后溶液的吸光度，分析蛋白质变性情况。
五、实验结果与分析1. 在不同温度下，随着温度升高，蛋白质变性程度逐渐加剧，吸光度降低。
2. 在不同pH值下，蛋白质在酸性或碱性条件下易变性，吸光度降低。
3. 在10%硫酸铵溶液中，蛋白质变性程度较高，吸光度降低。
4. 在95%乙醇中，蛋白质变性程度较高，吸光度降低。
5. 透析后，未变性的蛋白质被去除，溶液吸光度降低。
六、实验结论1. 温度、pH值、有机溶剂、重金属离子等物理或化学因素均可导致蛋白质变性。
生化实验报告
生化实验报告引言：生化实验是现代生物科学研究中不可或缺的一部分。
通过生化实验，可以深入了解生物体的分子组成和功能，揭示生物体的生理过程和相关疾病的发生机制。
本报告将就我们进行的一系列生化实验结果进行总结和分析。
实验一：蛋白质浓度测定实验蛋白质是生物体的重要组成部分，也是许多生理过程的关键调节因子。
通过本实验，我们采用比色法测定了不同样本中的蛋白质含量，并得出以下结论：1. 样本A的蛋白质浓度明显高于样本B，表明样本A可能含有更多的蛋白质。
2. 样本C的蛋白质浓度最低，可能是由于样本C中存在其他干扰物质，影响了测定结果。
实验二：酶活性测定实验酶是生物体内参与代谢反应的重要分子，其活性的变化可以反映生物体的生理状态。
本实验中，我们通过测定不同条件下酶的活性，得出以下结论：1. 酶活性随着温度的升高呈先增加后下降的趋势，说明酶在适宜温度下具有最高的活性。
2. pH值的变化对酶活性也有一定影响，酶活性在酸性和碱性条件下均降低，表明酶对于特定pH值有一定的适应性。
3. 离子浓度的改变可以显著影响酶的活性，高浓度的阳离子对酶活性的抑制效果较大。
实验三：DNA提取实验DNA是生物体内存储遗传信息的重要分子，在基因研究和生物技术中应用广泛。
本实验中，我们采用了几种常见的DNA提取方法，得出以下结论：1. 不同提取方法对于不同样本的DNA提取效果有所差异，需要根据实际情况选择合适的方法。
2. 样本中其他杂质的存在会干扰DNA的提取，需要进行适当的纯化步骤以提高提取纯度。
3. 所得到的DNA质量可以通过比色法或荧光法进行检测，得出相对准确的结果。
实验四：酸碱滴定实验酸碱滴定是一种常用的分析方法，在酸碱度测定和沉淀反应等方面有广泛应用。
本实验中，我们进行了一系列的酸碱滴定实验，得出以下结论：1. 强酸和强碱的滴定过程呈现出明显的酸碱中和点，通过计算可以得到溶液中目标物质的浓度。
2. 在滴定过程中，我们需要通过指示剂的颜色变化来判断滴定终点，需注意颜色的变化程度和持续时间。
生化反应鉴定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解生化反应在微生物鉴定中的重要性。
2. 掌握常见生化反应的原理和方法。
3. 通过实验，对给定的微生物进行鉴定。
二、实验原理生化反应是指微生物在生长过程中，通过酶的催化作用，将营养物质转化为自身所需的物质，同时产生一些代谢产物。
这些代谢产物可以用来鉴定微生物的种类。
常见的生化反应包括糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验等。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌等。
- 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂等。
- 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等。
- 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管等。
2. 仪器：- 酒精灯- 接种环- 超净工作台- 恒温培养箱- 高压灭菌锅- 试管- 移液枪- 滴管四、实验方法1. 菌种培养：将菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
2. 糖发酵试验：- 将培养好的菌种接种于糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖），置于恒温培养箱中培养24小时。
- 观察培养基颜色变化，记录发酵结果。
3. 吲哚试验：- 将培养好的菌种接种于蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
- 加入吲哚试剂，观察颜色变化，记录结果。
4. 甲基红试验：- 将培养好的菌种接种于蛋白胨水培养基，置于恒温培养箱中培养24小时。
- 加入甲基红试剂，观察颜色变化，记录结果。
五、实验结果与分析1. 糖发酵试验：- 大肠杆菌：发酵葡萄糖、乳糖，不发酵蔗糖。
- 金黄色葡萄球菌：不发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
- 枯草芽孢杆菌：不发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
- 变形杆菌：发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖。
2. 吲哚试验：- 大肠杆菌：吲哚试验阳性。
- 金黄色葡萄球菌：吲哚试验阴性。
- 枯草芽孢杆菌：吲哚试验阴性。
- 变形杆菌：吲哚试验阳性。
生化实验报告全文
一、实验目的1. 了解葡萄糖氧化酶（GOD）的催化作用原理。
2. 掌握测定葡萄糖氧化酶活性的方法。
3. 分析不同条件下葡萄糖氧化酶活性的变化。
二、实验原理葡萄糖氧化酶（GOD）是一种氧化还原酶，它催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和过氧化氢。
在实验中，通过测定过氧化氢的生成量来间接反映葡萄糖氧化酶的活性。
过氧化氢在特定条件下会分解生成水和氧气，利用氧气的生成量可以计算出过氧化氢的浓度，从而推算出葡萄糖氧化酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 试剂：- 葡萄糖标准溶液- 氧气电极- 氢氧化钠溶液- 酚酞指示剂- 水浴锅2. 仪器：- 721分光光度计- 恒温培养箱- 移液枪- 试管- 烧杯四、实验步骤1. 准备工作：- 将葡萄糖标准溶液配制成不同浓度的系列溶液。
- 配制好氢氧化钠溶液和酚酞指示剂。
2. 实验操作：- 将葡萄糖标准溶液加入试管中，加入适量的氢氧化钠溶液和酚酞指示剂。
- 使用移液枪将氧气电极插入溶液中，开始计时。
- 观察溶液颜色变化，记录溶液从粉红色变为无色所需的时间。
3. 数据处理：- 根据溶液颜色变化所需时间，计算出过氧化氢的生成量。
- 以葡萄糖浓度为横坐标，过氧化氢生成量为纵坐标，绘制标准曲线。
- 根据待测样品的浓度，从标准曲线上查得对应的过氧化氢生成量。
- 计算出待测样品的葡萄糖氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 以葡萄糖浓度为横坐标，过氧化氢生成量为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 待测样品的葡萄糖氧化酶活性：- 根据待测样品的浓度，从标准曲线上查得对应的过氧化氢生成量。
- 计算出待测样品的葡萄糖氧化酶活性。
3. 不同条件下葡萄糖氧化酶活性的变化：- 在不同温度、pH值和酶浓度下，观察葡萄糖氧化酶活性的变化。
六、实验结论通过本实验，我们成功测定了葡萄糖氧化酶的活性，并分析了不同条件下葡萄糖氧化酶活性的变化。
实验结果表明，葡萄糖氧化酶活性受温度、pH值和酶浓度等因素的影响。
生化大 实验报告
内蒙古大学生命科学学院生物系生物化学实验室生物化学大实验结题报告论文题目：重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析学生姓名：年级：专业：指导教师：2011年xx月xx日重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析X X（xxxxxxxxxxxxxxxxxxx(地址)）摘要: 将外源基因BAP克隆在含有lac启动子的表达载体coli中，让其在E. coli 中表达。
培养宿主菌，在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，而外源基因大量转录并高效表达。
将宿主菌进行超声波破碎，用亲和层析柱将蛋白分离纯化，最后SDS-PAGE检测转录表达蛋白，用Western-blotting方式分析蛋白特性。
关键词：细菌性碱性磷酸酶；亲和层析；SDS-PAGE；Western-blotting 碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称。
它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,是分子生物学中常用的工具酶之一。
它的作用是催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5'-Pi末端转换成5'-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。
而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。
碱性磷酸酶有两种来源：一种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,简称BAP)；BAP属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。
每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。
细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
生化实验的设计实验报告
一、实验目的1. 掌握从生物组织中提取DNA的基本原理和方法。
2. 学习使用酚-氯仿法进行DNA的粗提取和纯化。
3. 熟悉DNA的鉴定方法。
二、实验原理DNA是生物体内的重要遗传物质，具有独特的碱基序列。
在提取过程中，利用DNA与蛋白质、RNA等物质的溶解性差异，通过适当的化学试剂和操作步骤，将DNA从细胞中分离出来。
三、实验材料与仪器1. 材料：鸡血、无菌生理盐水、无水乙醇、氯化钠、酚-氯仿、NaCl溶液、DNA标准样品等。
2. 仪器：离心机、玻璃棒、量筒、烧杯、滴管、吸管、移液器、酒精灯、显微镜等。
四、实验步骤1. 鸡血采集：取鸡血2ml，加入10ml无菌生理盐水，充分混匀。
2. 细胞裂解：取2ml鸡血混合液，加入等体积的酚-氯仿，充分混匀后静置5分钟。
3. DNA沉淀：取上述混合液，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后静置10分钟。
4. DNA纯化：将上述混合液转移到离心管中，离心5分钟（8000r/min），弃去上清液。
5. DNA溶解：将沉淀用50μl NaCl溶液溶解，混匀。
6. DNA鉴定：取少量溶解后的DNA溶液，加入2μl DNA标准样品，观察颜色变化。
五、实验结果1. 在实验过程中，观察到鸡血混合液与酚-氯仿混合后分层，上层为红色，下层为无色。
2. 在DNA沉淀过程中，观察到白色沉淀形成。
3. 在DNA溶解过程中，观察到溶液颜色由白色变为无色。
4. 在DNA鉴定过程中，观察到溶液颜色与DNA标准样品颜色相似。
六、实验结论1. 成功从鸡血中提取了DNA。
2. 酚-氯仿法是提取DNA的有效方法。
3. DNA在生物组织中的提取具有实际应用价值。
七、实验讨论1. 实验过程中，酚-氯仿的加入有助于细胞裂解和DNA的提取。
2. 无水乙醇的加入有助于DNA的沉淀。
3. NaCl溶液的加入有助于DNA的溶解。
4. 实验过程中，注意操作规范，避免污染。
5. DNA提取过程中，温度、pH值等条件对实验结果有影响。
生化实验报告
生化实验报告实验目的，通过对不同生物体进行生化实验，探索其生物学特性和生化反应规律。
实验材料，小鼠、果蝇、大豆、细菌培养基、生化试剂等。
实验方法：1. 对小鼠进行实验，将小鼠分为实验组和对照组，实验组注射一定剂量的葡萄糖溶液，对照组注射生理盐水，观察小鼠的血糖水平变化和生化指标的变化。
2. 对果蝇进行实验，将果蝇分为实验组和对照组，实验组饲养在高温环境下，对照组饲养在常温环境下，观察果蝇的生长发育和生化代谢的差异。
3. 对大豆进行实验，将大豆种子浸泡在不同浓度的盐水中，观察大豆的生长情况和生化成分的变化。
4. 对细菌进行实验，将细菌接种在不同营养基上，观察其生长速度和代谢产物的差异。
实验结果：1. 小鼠实验结果显示，实验组小鼠的血糖水平显著升高，血清中的胰岛素水平下降，对照组小鼠的血糖水平无显著变化。
说明葡萄糖溶液注射导致小鼠胰岛素分泌不足，血糖升高。
2. 果蝇实验结果显示，高温环境下果蝇的寿命显著缩短，生化代谢速率加快，对照组果蝇的寿命正常，生化代谢速率稳定。
说明高温环境对果蝇的生化代谢产生负面影响。
3. 大豆实验结果显示，在高盐浓度环境下，大豆的生长受到抑制，生化成分中的蛋白质含量下降，对照组大豆的生长和生化成分无显著变化。
说明高盐浓度对大豆的生化代谢产生不利影响。
4. 细菌实验结果显示，不同营养基对细菌的生长和代谢产物有显著影响，说明细菌的生化代谢对营养基的需求存在差异。
实验结论，通过对不同生物体进行生化实验，我们发现生物体的生化代谢受到环境因素和营养因子的影响，不同生物体对外界环境和营养条件的适应能力不同，生化反应规律也存在差异。
这些实验结果为我们深入了解生物体的生化特性和生物学规律提供了重要参考。
实验展望，未来可以进一步探索生物体的生化代谢机制，研究生物体在不同环境和营养条件下的适应策略，为生物科学领域的研究提供更多的实验依据和理论支持。
结语，生化实验是生物学研究中的重要手段，通过对不同生物体的生化特性进行研究，可以深入了解生物体的生命活动规律，为生物科学领域的发展做出贡献。
生化实验报告
实验名称：DNA的提取与鉴定实验日期：2023年10月26日实验目的：1. 学习DNA提取的基本原理和操作步骤。
2. 掌握DNA的鉴定方法。
3. 了解不同生物样本中DNA提取的效率差异。
实验原理：DNA是生物体内携带遗传信息的分子，具有独特的双螺旋结构。
本实验通过破碎细胞膜，释放细胞内的DNA，然后通过一系列物理和化学方法提取纯净的DNA。
DNA 的鉴定主要通过观察其在紫外光下的荧光反应来实现。
实验材料：1. 鲜肉（作为动物组织样本）2. 青菜（作为植物组织样本）3. 氯化钠4. 硫酸铵5. 乙醇6. 0.1% DEPC水7. 1% CTAB缓冲液8. 5M NaCl溶液9. 70% 乙醇10. 紫外分光光度计11. 0.5%二苯胺溶液12. 100mg/ml 柠檬酸钠溶液13. 100mg/ml 氯化钠溶液14. 100mg/ml 柠檬酸溶液15. 100mg/ml 氯化钾溶液16. 离心机17. 实验器材：研钵、研杵、移液器、离心管、试管、酒精灯、显微镜等实验步骤：1. 组织样本的处理：- 将鲜肉和青菜分别切成小块，放入研钵中。
- 加入适量DEPC水，用研杵充分研磨，使组织细胞破碎。
2. DNA的提取：- 向研磨好的样本中加入1% CTAB缓冲液，混匀。
- 65℃水浴30分钟，使蛋白质变性。
- 加入5M NaCl溶液，混匀。
- 4℃静置30分钟，使DNA沉淀。
- 4℃离心，取上清液。
- 向上清液中加入等体积的70% 乙醇，混匀。
- 4℃静置30分钟，使DNA沉淀。
- 4℃离心，弃去上清液。
- 向沉淀中加入DEPC水，溶解DNA。
3. DNA的鉴定：- 取少量提取的DNA溶液，加入0.5%二苯胺溶液。
- 100℃水浴5分钟，观察颜色变化。
- 若出现蓝色，则说明DNA提取成功。
实验结果：1. 鲜肉样本中提取的DNA溶液加入二苯胺溶液后，呈现蓝色，表明DNA提取成功。
2. 青菜样本中提取的DNA溶液加入二苯胺溶液后，呈现蓝色，表明DNA提取成功。
生化大实验实验报告范文
生化大实验实验报告范文一蛋白质提取、纯化及分析技术实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组200-300g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配某10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，0.005mMgCL2）配置时配。
（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1：粗酶提取：马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
2：盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。
沉淀用0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02NKCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
三、实验结果获得PPO粗酶液供上柱使用。
实验二柱层析纯化PPO一、材料与试剂试剂：0.02MTri-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配某10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephade某G-200等；实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的Sephade某G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
生化大实验报告
生化实验报告[键入文档副标题]实验一多酚氧化酶（PPO）的分离与提取一、实验目的1、本实验以马铃薯为主要的实验材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
2、通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、实验原理多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，参与植物抗体的调节，属于末端氧化酶的一种。
在植物体受到机械损伤和病毒感染后，PPO催化酚与氧氧化成醌，使组织形成褐变，对PPO弄得的测定便是通过PPO氧化酚产生醌的变色反应测定其酶活性。
在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。
这种现象称为盐溶；而在蛋白质水溶液中继续加入无机盐类可以其溶解度降低而析出的过程，该现象称为盐析。
蛋白本身随盐浓度的溶解度变化曲线具有特征性，可以依据此分离蛋白，硫酸铵分级便依据此原理，首先在蛋白质溶解度最高时，离心取上清，去除此时未溶解或已经沉淀的杂蛋白，之后再其溶解度最低且未变性的时候离心取沉淀复溶，去除尚未析出的杂蛋白，从而达到纯化目的蛋白的目的。
多酚氧化酶在40%硫酸铵溶液中溶解度最高，而在75%硫酸铵溶液中沉淀量最高，由此可分离提取多酚氧化酶。
但使用硫酸铵分级，分离后的产物中会有铵根离子残留，如果采用凯氏定氮法测定蛋白质浓度时，残留的铵根离子会造成测定时高于实际值，同时该样品之后会用于离子交换层析纯化，所以需要去除其中的离子，故需要透析去除其中铵根离子。
多酚氧化酶提取在PH6.0的中性偏酸条件下进行，在此PH值下，磷酸缓冲液的缓冲能力最强，故选择使用其作为缓冲液，其中加入的EDTA为螯合剂，聚乙烯比咯烷酮是用于吸附醌，本身为固体颗粒，不需要溶解。
三、仪器与试剂：（1）马铃薯200g（2）试剂：溶液A：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯比咯烷酮）固体硫酸铵溶液B：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005M 氯化镁）实验器械与仪器设备：烧杯，玻璃棒，量筒，天平，高速冷冻离心机，离心杯，透析袋，植物组织匀浆器，过滤纱布。
生化实验报告_仲恺
实验名称：DNA的提取与鉴定实验目的：1. 学习DNA提取的基本原理和方法。
2. 掌握实验操作技能，提高实验操作规范性。
3. 通过实验，了解DNA在生物科学研究中的重要性。
实验时间：2023年X月X日实验地点：仲恺农业工程学院生物实验室实验材料：1. 鲜鸡血2. 生理盐水3. 0.9% NaCl溶液4. 95% 乙醇5. 70% 乙醇6. 2mol/L醋酸钠溶液7. 碘液8. 试管、移液器、离心机、显微镜等实验方法：1. 血液采集：采集鲜鸡血2ml，加入2ml生理盐水，充分混匀。
2. 裂解细胞：将混合液加入2ml 2mol/L醋酸钠溶液，充分混匀后，加入2ml 95%乙醇，室温静置5分钟。
3. 离心：将上述混合液以3000r/min离心5分钟，弃去上清液。
4. 洗涤：向沉淀中加入2ml 70%乙醇，充分混匀后，以3000r/min离心5分钟，弃去上清液。
5. 溶解：将沉淀加入1ml蒸馏水，充分溶解。
6. DNA鉴定：取少量DNA溶液，加入适量碘液，观察溶液颜色变化。
实验结果：1. DNA溶液呈深蓝色，表明DNA提取成功。
2. 在显微镜下观察，可见DNA呈丝状结构。
实验分析：1. DNA提取过程中，裂解细胞是关键步骤，本实验采用醋酸钠和乙醇的混合液裂解细胞，效果良好。
2. 离心洗涤过程中，注意弃去上清液，以免DNA损失。
3. DNA鉴定方法简单易行，便于观察。
实验结论：1. 本实验成功提取了鸡血中的DNA。
2. 提取的DNA呈深蓝色，且在显微镜下可见丝状结构，表明DNA提取纯度较高。
实验讨论：1. DNA提取过程中，裂解细胞的方法有很多种，如使用蛋白酶K、氯化钠等，可根据实验需要选择合适的方法。
2. DNA提取过程中，注意控制实验条件，如温度、pH值等，以保证DNA提取效果。
3. DNA提取技术在生物科学研究中具有重要意义，如基因克隆、基因测序等。
实验注意事项：1. 实验过程中，注意操作规范，避免污染。
现代女性生化实验报告
实验名称：现代女性生化指标检测实验目的：1. 了解现代女性常见的生化指标及其正常范围。
2. 分析不同年龄、职业、生活习惯等因素对女性生化指标的影响。
3. 掌握生化实验的基本操作方法，提高实验技能。
实验时间：2023年4月15日实验地点：某三甲医院生化实验室实验材料：1. 现代女性样本：20名，年龄20-45岁，职业包括教师、护士、公务员、企业员工等。
2. 生化检测仪器：全自动生化分析仪、离心机、试剂等。
3. 实验记录表。
实验方法：1. 样本采集：采集每位女性的静脉血5ml，置于抗凝管中。
2. 样本处理：将采集到的血液在室温下静置30分钟，待血液凝固后，用离心机以3000r/min离心10分钟，分离血清。
3. 生化指标检测：使用全自动生化分析仪对血清进行以下指标的检测：- 血清白蛋白（ALB）- 谷丙转氨酶（ALT）- 谷草转氨酶（AST）- 总胆固醇（TC）- 高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）- 低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）- 三酰甘油（TG）- 糖化血红蛋白（HbA1c）- 尿素氮（BUN）- 肌酐（Cr）- 钠（Na+）- 钾（K+）- 氯（Cl-）- 碳酸氢盐（HCO3-）4. 数据分析：将检测结果与正常参考范围进行比较，分析不同年龄、职业、生活习惯等因素对女性生化指标的影响。
实验结果：1. 血清白蛋白（ALB）：正常范围为35-55g/L，20名女性样本中，有18人处于正常范围，2人低于正常范围。
2. 谷丙转氨酶（ALT）：正常范围为5-40U/L，20名女性样本中，有19人处于正常范围，1人高于正常范围。
3. 谷草转氨酶（AST）：正常范围为8-40U/L，20名女性样本中，有19人处于正常范围，1人高于正常范围。
4. 总胆固醇（TC）：正常范围为2.86-5.17mmol/L，20名女性样本中，有17人处于正常范围，3人高于正常范围。
5. 高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）：正常范围为1.03-1.55mmol/L，20名女性样本中，有16人处于正常范围，4人低于正常范围。
生化检测实验报告
生化检测实验报告生化检测实验报告一、引言生化检测是一种重要的实验方法，通过对生物体内的化学成分进行定量分析，可以了解生物体的健康状况、代谢情况以及潜在的疾病风险。
本实验旨在通过对血液样本进行生化检测，探究人体内各种生化指标的变化情况。
二、实验目的1. 了解生化检测的基本原理和方法；2. 掌握血液样本的采集和处理技巧；3. 分析血液中的生化指标，探究其与身体健康的关系。
三、实验材料与方法1. 实验材料：血液采集器、离心机、试剂盒等；2. 实验方法：a. 采集血液样本；b. 将血液样本离心分离血浆和血细胞；c. 使用试剂盒进行生化指标的检测；d. 通过数据分析，得出实验结果。
四、实验结果与分析1. 血红蛋白浓度：实验结果显示，受试者的血红蛋白浓度在正常范围内，说明其血液携氧能力良好。
2. 血糖水平：实验结果显示，受试者的血糖水平较高，可能存在糖尿病的风险。
建议受试者注意饮食，控制血糖摄入。
3. 血脂水平：实验结果显示，受试者的总胆固醇和甘油三酯水平超过了正常范围，提示其存在高血脂的情况。
建议受试者加强运动，控制饮食，降低血脂水平。
4. 肝功能指标：实验结果显示，受试者的肝功能指标正常，说明其肝脏功能良好。
5. 肾功能指标：实验结果显示，受试者的肾功能指标正常，说明其肾脏功能良好。
五、实验结论通过本次生化检测实验，我们得出以下结论：1. 受试者的血红蛋白浓度正常，血液携氧能力良好；2. 受试者的血糖水平较高，存在糖尿病的风险，需注意饮食控制；3. 受试者的血脂水平超过了正常范围，存在高血脂的情况，需加强运动和控制饮食；4. 受试者的肝功能和肾功能正常，说明其肝脏和肾脏功能良好。
六、实验的局限性与改进方向1. 本实验样本数量较少，无法代表整个人群的情况，需要进一步扩大样本量；2. 本实验只针对常见的生化指标进行检测，未涉及其他重要指标，需要进一步完善实验设计。
七、实验的意义与应用前景生化检测在医学领域具有广阔的应用前景。
生化大实验实验报告
0.11 4
2.35 1 1.98 8
0.36 3
1.03 0 0.86 7
0.16 3
0.67 7 0.10 3
0.57 4
（6）脲对蔗糖酶的抑制作用 取做好编号的试管，按下表进行实验。 管号 0.5mol/L 蔗糖/μl 蔗糖酶/μl 乙酸缓冲液 pH5.0/μl 4mol/L 脲/μl
H 2O /μl
2 0.2 0.2 0.6 40 1
3 0.2 0.2 0.6 50 3
4 0.2 0.2 0.6 50 6
5 0.2 0.2 0.6 60 10
6 0.2 0.2 0.6 60 15
7 0.2 0.2 0.6 70 20
8 0.2 0.2 0.6 70 30
9 0.2 0.2 0.6 80 40
10 0.2 0.2 0.6 80 50
8 0.8 16 0.2 2 1.33 8
9 0.9 18 0.1 2 1.48 2
10 1.0 20 0.0 2 1.60 8
水杨酸试剂/ml
沸水浴 5min，流水冷却，定容至 15ml
A540
0
(2)反应时间的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。 管号 0.2mol/L 蔗糖/ml 乙酸缓冲液 pH5.0/ml
H 2O /μl
1 0 600 200 200 1.0 2.0
2 20 580 200 200 1.0 2.0
3 30 570 200 200 1.0 2.0
4 40 560 200 200 1.0 2.0
5 60 540 200 200 1.0 2.0
6 80 520 200 200 1.0 2.0
H 2O /μl
0.05
创新生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着生物技术的快速发展，人们对生物化学领域的探究越来越深入。
为了进一步提高学生的实践能力和创新能力，我们小组开展了一项创新生化实验——蛋白质等电点测定。
本实验旨在了解蛋白质等电点的概念、测定方法以及影响蛋白质等电点的因素。
二、实验目的1. 理解蛋白质等电点的概念及意义；2. 掌握蛋白质等电点的测定方法；3. 分析影响蛋白质等电点的因素；4. 提高学生的实验操作技能和创新能力。
三、实验原理蛋白质在溶液中的带电性质与其氨基酸组成、溶液pH值等因素有关。
当溶液pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质所带正负电荷数量相等，净电荷为零，此时蛋白质的溶解度最小，容易析出。
蛋白质等电点的测定方法主要有电泳法、滴定法等。
四、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、氯化钠、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、酚酞指示剂等；2. 实验仪器：分析天平、移液管、滴定管、电热恒温水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统等。
五、实验步骤1. 准备蛋白质溶液：取一定量的鸡蛋清，用氯化钠溶液进行稀释，得到蛋白质溶液；2. 测定蛋白质溶液的初始pH值；3. 逐滴加入氢氧化钠溶液，直至溶液pH值达到蛋白质等电点；4. 逐滴加入盐酸溶液，直至溶液pH值达到蛋白质等电点；5. 分别测定蛋白质在等电点时的溶解度；6. 记录实验数据，分析影响蛋白质等电点的因素。
六、实验结果与分析1. 蛋白质溶液的初始pH值约为7.4；2. 在加入氢氧化钠溶液的过程中，蛋白质溶液的pH值逐渐升高，当pH值达到7.0时，蛋白质开始析出；3. 在加入盐酸溶液的过程中，蛋白质溶液的pH值逐渐降低，当pH值达到4.0时，蛋白质开始析出；4. 通过实验数据，发现蛋白质在等电点时的溶解度最小，且受pH值、离子强度等因素的影响。
七、结论1. 蛋白质等电点是蛋白质在溶液中带电性质发生变化的临界pH值；2. 通过电泳法可以测定蛋白质的等电点；3. 蛋白质的等电点受pH值、离子强度等因素的影响。
医学检验生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验名称血清酶活性检测二、实验目的1. 掌握血清酶活性检测的基本原理和方法。
2. 学会使用生化分析仪进行血清酶活性检测。
3. 了解血清酶活性检测在临床诊断中的应用。
三、实验原理血清酶活性检测是通过测定血清中某种酶的活性来反映该酶在体内的代谢状况。
酶活性测定通常采用比色法、电化学法等方法，其中比色法是最常用的方法。
本实验采用比色法检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的活性。
四、实验材料1. 试剂：丙氨酸转氨酶（ALT）试剂盒、天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒、缓冲液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、硫酸钠、氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸等。
2. 仪器：生化分析仪、离心机、移液器、比色皿等。
3. 样品：血清样本。
五、实验步骤1. 样本处理：取血清样本，按照实验要求进行离心处理，分离出血清。
2. 丙氨酸转氨酶（ALT）活性检测：（1）按照试剂盒说明书配置反应体系，加入血清样本。
（2）将反应体系放入生化分析仪中，按照仪器操作步骤进行测定。
3. 天冬氨酸转氨酶（AST）活性检测：（1）按照试剂盒说明书配置反应体系，加入血清样本。
（2）将反应体系放入生化分析仪中，按照仪器操作步骤进行测定。
4. 结果记录与分析：记录实验数据，与正常值范围进行比较，分析实验结果。
六、实验结果1. 丙氨酸转氨酶（ALT）活性检测结果：实验测得的ALT活性为30 U/L，正常值范围为10-40 U/L。
2. 天冬氨酸转氨酶（AST）活性检测结果：实验测得的AST活性为25 U/L，正常值范围为15-35 U/L。
七、讨论与分析1. 丙氨酸转氨酶（ALT）活性检测：ALT主要存在于肝脏细胞中，其活性升高可反映肝脏损伤。
本实验中ALT活性检测结果在正常范围内，说明受试者肝脏功能正常。
2. 天冬氨酸转氨酶（AST）活性检测：AST广泛存在于人体各组织中，但以肝脏细胞中的含量最高。
AST活性升高可反映心肌损伤、肝脏损伤等。
生化实验室活体实验报告(3篇)
第1篇实验名称：细胞培养与细胞染色观察实验目的：1. 学习细胞培养的基本操作和注意事项。
2. 掌握细胞染色技术，观察细胞形态和结构。
3. 了解细胞生长周期及其在不同培养条件下的变化。
实验时间：2023年X月X日实验地点：生化实验室实验材料：1. 细胞株：人肺上皮细胞（A549）2. 培养基：DMEM培养基3. 细胞培养瓶：25cm²培养瓶4. CO2培养箱5. 离心机6. 显微镜7. 细胞染色剂：姬姆萨染液8. 吸管、移液器、试管等实验器材实验步骤：1. 细胞复苏：- 将冻存的细胞株取出，用DMEM培养基溶解。
- 将溶解后的细胞悬液离心，弃去上清液。
- 用DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个细胞/mL。
2. 细胞接种：- 将25cm²培养瓶用75%乙醇消毒，晾干。
- 将细胞悬液接种于培养瓶中，每瓶接种1mL。
- 将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃、5%CO2培养。
3. 细胞培养：- 每隔24小时更换一次培养基。
- 观察细胞生长情况，记录细胞生长周期。
4. 细胞染色：- 取对数生长期的细胞，用胰酶消化。
- 收集细胞，离心，弃去上清液。
- 用姬姆萨染液染色30分钟。
- 水洗，晾干。
5. 显微镜观察：- 将染色后的细胞涂片放在显微镜下观察。
- 观察细胞形态、核质比、细胞核染色质等。
实验结果：1. 细胞培养成功，细胞生长旺盛，呈典型的铺路石状排列。
2. 细胞染色效果好，细胞核染色质清晰，核质比适中。
3. 观察到细胞生长周期为G1期、S期、G2期和M期。
实验讨论：1. 细胞培养过程中，应注意无菌操作，避免污染。
2. 细胞染色剂的选择和浓度对染色效果有重要影响。
3. 细胞生长周期受多种因素影响，如培养基成分、温度、CO2浓度等。
实验结论：本次实验成功培养了人肺上皮细胞，并观察了细胞形态和结构。
细胞染色效果良好，成功观察到细胞生长周期。
实验结果表明，细胞培养和染色技术在生物学研究中具有重要意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
诱导后的菌体置于大离心管中，5000rpm 离心 15min，弃上清。加入 1/10 体积的破碎缓冲液洗涤。离心 15min 5000rpm 去上清，加入破碎缓冲液及终浓度 为 50μl/5ml 的溶菌酶（现用现配，母液 100mg/ml）。 30℃温浴 15min。（离心 时调好 30℃的水浴摇床）。在冰浴条件下，60%功率超声处理 5min（具体做法是 每管中 0.5ml 样品，每五管一组，放于冰浴中连续处理，每管 4 秒，再重复，直 到处理 5min 为止。再用 40%功率超声处理 5min）。
超声要求 a 将菌液处理至清亮；b 始终保持低温环境；c 避免出现黑色沉淀。 将超声处理后的样品于 4℃ 2000rpm 离心 10min，沉淀为细胞碎片弃去。上清再 于 4℃ 12000rpm 离心 10min。上清为可溶性蛋白，沉淀为包涵体。（包涵体留样 1ml，可溶性蛋白留样 100μl）。
2.4 上亲和柱
清洗转移电泳槽等装置。蒸馏水漂洗点有预染 Marker 的胶。然后浸泡在转 移缓冲液中。戴上手套用镊子夹住 PVDF 膜。先在甲醇中精确处理 15 秒。然后放 入蒸馏水槽中漂洗一下，最后放于盛有转移缓冲液的盆中平衡 15min。同时将 4 片滤纸 2 块海绵浸泡在转移缓冲液中。尽量用玻璃棒赶去海绵中的气泡（否则易 短路）。按照阴极黑板—海绵垫—2 层滤纸—凝胶—PVDF 膜—2 层滤纸—海绵垫 —阳极红板的顺序装。80mA 恒流下在转移电泳槽中冰浴电泳 2.5 小时。取出 PVDF 膜放于干燥滤纸上片刻，但不要吸干膜。灭菌去离子水中冲洗。
3
生化实验报告
2.5 BAP 的分子筛排阻层析
亲和层析的样品第 2、3、4 管分别取 400µl 混匀于 1.5ml 离心管中上柱，重 力使之渗入柱子。样品接近界面时，加入 1ml 起始缓冲液。打开泵开始收集（加 样时即打开读纸器），在峰顶处留样测定酶活。关读纸机。然后用 20ml 0.1M Nacl 的处理柱子。洗柱，用超纯水洗 30min 左右。
2.2 BAP 的诱导表达
在 5ml 培养基中加入 Amp 2.5μl（母液为 100mg/ml）和 10μl 菌液。在摇 床上 37℃ 130 转过夜预培养。之后取预培养的菌液 2.5ml，将菌液加入 50ml 含 有 Amp (25μl)的 LB 培 养 基中 以 1:20 的比 例 扩 增。 在 37 ℃恒温 摇 床 ， 以 180-200rpm 培养 40-60min 左右。之后加入终浓度为 1mM 的 IPTG(500μl)进行外 源基因的诱导表达。于室温诱导 4-5 小时。取出诱导细胞进行细胞超声破碎，留
清洗电泳槽，玻璃板（用海绵块洗），胶条等电泳装置，然后用卫生纸轻轻 吸水晾干。组装玻璃板（凹面向外），封胶条，要贴紧玻璃板，胶条下端要平直 并且胶条始终要自然弹性范围不要用力拽。每组装好后让老师检查后再去灌胶。 2.6.3 分离胶及浓缩胶的配置
准备一个小烧杯，按照实验讲义的配方配。12%的分离胶，混匀后立即用取 液器加入玻璃板中，加至红线处。然后加入 1ml 的超纯水。静置 30min。待胶凝 固后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。
2
生化实验报告
1ml 破碎前菌液， 处理后进行 western 及 PAGE，其余放入冰箱于 4 度保存。
2.3 BAP 的亲和层析纯化
2.3.1 盐酸胍破碎 将 100ml 诱导后的菌液分别放于大离心管中，配平，5000rpm 离心 15min。
弃去上清液加入 1/10 体积 PH8.0 磷酸钠缓冲液（20mM）重悬后 5000rpm 离心 10min， 去上清。在沉淀中加入 1/10 体积的 6M 的盐酸胍溶液（注：盐酸胍要用 20mM 的 磷酸钠缓冲液溶解）。用玻动棒搅开后在 30℃的摇床 10min。分装于 1.5ml 离心 管中，12000rpm 离心 10imn，取上清，上样（留 100μl 上样前的蛋白样品）。 2.3.2 超声波破碎
缓慢向柱中加入样品 4ml 打开层析柱上下端，使样品靠重力流出。当样品接 近 界 面 时 在柱 中 加 入 3ml 上 样缓 冲液 （即平 衡液 ），连 接 泵，调 T=100 ， A(0.5A)=0 ,开启记录仪，同时配制 100ml 0.1M Nacl。待两个峰都出来后，把 层析杯中的液体换为 0.1M Nacl 洗柱 20min，再用超纯水洗柱 30min，封柱，关 机。
将 PVDF 膜放入玻璃平皿中加入封闭液（10mlTBS，10ml，0.25g 脱脂奶粉）， 在摇床上封闭 2 小时。取出 PVDF 膜，在 1XTBS 中漂洗 2 次后放入平皿中加入 10ml 一抗封闭液（10ml 1×TBS，5μl 吐温，5μl 一抗，0.5g 奶粉），在脱色摇床上
配 5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃 板凹面相平。静置 30min。 2.6.4 准备及电泳
待浓缩胶凝固后垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内 重新组装，然后向内外槽加入电极缓冲液（内槽一定要加满）。
按顺序依次点样，两块胶一块做 SDS 染色（普通 Marker），另一块做 western 杂交（点预染 Marker）。Marker 要提前处理。
将电泳装置与电泳电源连接。调电压 60V。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，换 成 90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停止电泳。电泳完 毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通 Marker 的胶 浸泡在染色液中。染色→脱色→水洗（过夜）。预染 Marker 的胶进行转膜处理。
1
生化实验报告
1 材料与试剂
1.1 菌种
大肠杆菌工程菌株 BL21(DE3)
1.2 实验试剂
葡聚糖 G-75 干粉、 Tris-HCl、NaCl、标准蛋白、IPTG（异丙基硫代-β-D半乳糖）、starting buffer、8 M/L 尿素、乙醇、咪唑、Marker、PVDF 膜、TBS、 吐温、一抗、酶标二抗，牛血清蛋白，糜蛋白酶、PNPP 等试验试剂。
将电泳装置与电泳电源连接（注意正负极）。调电压 60V。待溴酚蓝前沿进
4
生化实验报告
入分离胶后，换成 90V 电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停 止电泳。 2.6.4 电泳胶处理
电泳完毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通 Marker 的胶浸泡在染色液中。染色→脱色→水洗（过夜）。预染 Marker 的胶进 行转膜处理。
2 方法与步骤
2.1 装柱及标准样品的分子筛层析
把柱子固定在夹子上，打开下面的盖，用取液器匀速加入介质。保证介质均 匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与 柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。液体接近界面时加入 3ml 超纯水，同时在层析杯中加入 100ml 超纯水，连接泵洗柱 15min，同时配制 平衡液 200mL（20mmol Tris-HCl,pH 8.0; 20mmol NaCl）。待液体接近界面时， 在柱中加入 3ml 平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为 3ml/10min（一分钟约 6-7 滴）。平衡柱过中午。
清洗电泳槽，玻璃板，胶条等电泳装置，然后用滤纸轻轻吸水晾干。组装玻 璃板（凹面向外），封胶条要贴紧玻璃板，胶条下端要平直，并且胶条始终要自 然弹性范围不要用力拽。准备一个小烧杯，配制 12%的分离胶，混匀后立即用取 液器加入玻璃板中，加至红线处。再加入 1ml 的超纯水，静置 30min。待胶凝固 后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。配制 5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳 子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃板凹面相平。静置 30min。待浓缩胶凝固后 垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃板凹面向内重新组装，然后向内 外槽加入电极缓冲液。按顺序依次点样，两块胶一块做 SDS 染色（普通 Marker）， 另一块做 western 杂交（点预染 Marker）。Marker 要提前处理。
2.6 SDS-PAGE
2.6.1 样品处理 包涵体处理：在留样的沉淀中加入 500μl 8M 的尿素，摇匀。取 20μl 于
1.5ml 离心管中，再加入 50μl 上样缓冲液，于 100℃沸水中煮沸 5min。菌体处 理：将留样的 1ml 菌体于 12000rpm 离心 1min，用滤纸吸干残液，用 100μl 上 样缓冲液重悬菌体，100℃沸水中煮沸 5min。亲和层析样品处理：取亲和层析样 品，2 和 3 号管各 20μl 于 1.5ml 离心管中，再加入 20μl 上样缓冲液，于 100℃ 沸水中煮沸 5min。待样品冷却后 12000rpm 离心 5min。 2.6.2 清洗安装
学号
内蒙古大学生命科学学院生物系 生物化学实验室
生物化学大实验结题报告
论文题目：重组细菌性碱性磷酸酶的分离、 纯化及特性分析
学生姓名： 年 级： 专 业： 指导教师：
2011 年 xx 月 xx 日
生化实验报告
重组细菌性碱性磷酸酶的分离、纯化及特性分析
XX （xxxxxxxxxxxxxxxxxxx(地址)） 摘 要: 将外源基因 BAP 克隆在含有 lac 启动子的表达载体 coli 中，让其在 E. coli 中表达。培养宿主菌，在培养基中加入诱导物 IPTG（异丙基硫代-β-D-半 乳糖），使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，而外源基因大量转录并高效表达。将 宿主菌进行超声波破碎，用亲和层析柱将蛋白分离纯化，最后 SDS-PAGE 检测转 录表达蛋白，用 Western-blotting 方式分析蛋白特性。 关键词：细菌性碱性磷酸酶；亲和层析；SDS-PAGE；Western-blotting 碱性磷酸酶是适于在 pH 约 9-10 的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷 酸游离的磷酸脂酶的总称。它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,是分子生物学 中常用的工具酶之一。它的作用是催化核酸分子脱掉 5’磷酸基团，从而使 DNA(或 RNA)片段的 5'-Pi 末端转换成 5'-OH 末端，这也就是所谓的核酸分子的 脱磷酸作用。而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。碱性磷酸酶有两种来源：一 种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,简称 BAP)；BAP 属于同源二聚体蛋白，分子量为 56KDa。每个单体 由 449 个氨基酸组成，完整的 AKP 分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个 单体均具有一个活性中心，活性中心区域由 Asp101-Ser102-Ala103 三连体、 Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。细菌性碱性磷酸酶是一种 能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除 去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而 该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。其最适 pH 是 8.0。上图为 细菌性碱性磷酸酶二级结构。 实验中使用我们在应用基础研究中建立的表达重组 His-BAP 的大肠杆菌 BL21(DE3) 工 程 菌 株 ， 在 IPTG 的 诱 导 下 表 达 有 活 性 的 重 组 His-BAP 并 通 过 SDS-PAGE 和 Western-blotting 进行鉴定。本实验技术路线：重组蛋白的诱导表 达→重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白的分子筛排阻层析纯化→SDS-PAGE 电泳 及 Western-blot 鉴定重组蛋白→重组蛋白活性的检测。