生化实验合集学习资料
实验四甲醛滴定法测定氨基氮
一.目的
初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。
二.原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：
－NH3是弱酸，完全解离时PH为11－12或更高，若用碱滴定－NH3所释放的H＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。
三.仪器、试剂、材料
1.仪器
25ml锥形瓶；3ml微量滴定管；吸管；研钵。
2.试剂
(1)300ml 0.05mol/L标准甘氨酸溶液
准确称取375mg 甘氨酸，溶解后定容至100ml。
(2)500ml 0.02mol/L标准氢氧化钠溶液
(3)20ml酚酞指示剂
0.5 ％酚酞的50 ％乙醇溶液
(4)400 ml中性甲醛溶液
在50ml 36－37 ％分析纯甲醛溶液中加入1ml 0.5％酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
四.操作方法
1.取3个25 ml的锥形瓶，编号。向1、2号瓶内各加入0.05mol/L标准甘氨酸溶液2ml和水5ml，
混匀。向3号瓶内加入7 ml水。然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2 ml甲醛
溶液再混匀，分别用0.02mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值，计算甘氨酸
氨基氮的回收率。
2.取未知浓度的甘氨酸溶液2ml，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每毫升甘氨
酸溶液中含有氨基氮的毫克数。
五.结果处理
1.回收率计算：
甘氨酸氨基氮回收率％＝实际测得量
×100 加入理论量
公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。
2.氨基氮计算：
氨基氮（毫克/毫升）= （V未－V对）×N NaOH×14.008
2
公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。V对为滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。N NaOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。
六.注意事项
1.标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余
氢氧化钠。
2.中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。
3.本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学
要求进行。
4.脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。
七.思考题
甲醛滴定法为什么不能准确测定含有多种氨基酸的样品中的氨基氮？
实验六蛋白质的盐析和透析
1．目的要求
掌握蛋白质盐析和透析两种操作，了解蛋白质盐析和透析的原理与影响因素。
2．方法原理
在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析，盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。
蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装人透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。
3．主要实验仪器及材料
鸡蛋；氯化钠；硫酸铵；硝酸银；硫酸铜；氢氧化钠；火棉溶液。
４．掌握要点
蛋白质盐析
５．实验步骤
1）蛋白质盐析
取10%鸡蛋白溶液5mL于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出。
2）蛋白质的透析
6．实验思考题
1）蛋白质的盐析和透析在生产和科研中有哪些具体的应用价值？
2）如何在盐析和透析操作中维持蛋白质的各种活性？
3）如果要进一步分离不同种类、分子量的蛋白质，还有哪些实验手段？
实验三氨基酸的分离鉴定--纸层析法
学时数：4学时
一、目的：
学习分配层析的原理；掌握氨基酸纸层析法的操作技术要点；并了解氨基酸的呈色反应原理。
二、原理：
※分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。混合物之间的分配系数相差越大，越容易分开。通常用α表示分配系数。一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定温度下是一个常数。
※纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，纸纤维上的－OH具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，有机溶剂通常作为流动相。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。
※氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。氨基酸被分离后，在层析图谱上的位置用R f （比移）表示。R f的主要决定因素是分配系数，另外还与物质的结构、溶剂系统、滤纸质量及层析温度等条件有关。
三、器材：
层析缸、毛细管、喷雾器、层析滤纸、电吹风
四、试剂：
展层剂（水饱和的正丁醇与醋酸的混合物）、氨基酸溶液（Pro、Val、Leu及其混合液）、茚三酮显色剂
五、步骤：（取滤纸时，始终拿滤纸边缘）
1、平衡：将展层剂置于层析缸中进行平衡。
2、标记：取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2－3cm处用铅笔划一直线，在此直线上，每隔2－3cm做一记号（点样点）。
3、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在标记的位置上，干后在原来点样位置再点一次（可用吹风机吹干，但要控制温度不能太高）。注意，每点的扩散直径不能超过3mm。
4、展层：用线将滤纸缝成筒状（用透明胶粘也可以），注意滤纸的两边不能接触！！缝好后，将滤纸直立于层析缸中。（点样端在下，展层剂的液面需低于点样线）待溶剂上升15cm左右（约40min），取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，吹风机吹干。
5、显色：用喷雾器均匀喷上茚三酮显色液（要离开滤纸一定距离且要直立喷洒，显色液在滤纸上不能成柱状流下）；热风吹干，可见显色的各层析斑点。
6、计算：计用直尺量出原点到溶剂前沿及各层析点中心的距离，分别计算R f值；并通过比较单种氨基酸样品与混合液中氨基酸的R f值，指出相对应的氨基酸。
六、结果：
实验九阳离子交换树脂摄取氯化钠
学时数：3学时
一、目的：
学习并掌握离子交换层析法的原理和基本操作技术
二、原理：
离子交换层析法是利用各种离子对交换剂的亲和力程度不同而达到分离的方法。本实验利用阳离子交换树脂摄取氯化钠，作为柱层析的基本训练。
三、器材：
碱性滴定管、层析管、锥形瓶、玻璃棒、强酸型阳离子交换树脂、移液管等 四、试剂：
盐酸，氢氧化钠，10g/L 的氯化钠，0.1mol/L 的标准氢氧化钠溶液，酚酞指示剂 五、步骤：
1、树脂处理、转型：水浸过夜→盐酸浸泡→氢氧化钠溶液浸泡→盐酸转型→水洗至中性待用
2、装柱：采用重力沉降法
关闭层析柱下端出口，用小烧杯将处理好的氢型树脂和水一起取适量，用玻璃棒一边搅拌一边加入层析柱，不要有气泡和分层，打开下端出口，当顶部水快干时，关闭出口。
3、加样：加入6ml 10g/L 的氯化钠溶液，当溶液的弯月面在树脂顶端时，用蒸馏水洗脱。
4、洗脱：收集40ml 洗脱液
5、滴定：用0.1mol/L 的标准氢氧化钠溶液滴定洗脱液
6、计算
六、 结果：
实验十、植物材料基因组DNA 的提取、基因组DNA 纯度与含量的测定
一、 实验目的要求
学习和掌握植物基因组DNA 的提取纯化方法。 二、 实验原理
利用基因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领域，植物基因工程
操作离不开植物基因组DNA 的制备。利用基因组较长的特性可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA 分离，加入一定量的异戊醇或乙醇，基因组的大分子DNA 即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，而小分子DNA 则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到分离的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA 时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA 。
植物中的次生代谢产物一多酚类化合物可以介导 DNA 降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度
最常见的问题。这些多糖能抑制限制酶，连接酶及DNA 聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。应考虑去除多糖和酚类物质。
三、 实验材料、试剂和仪器 四、 操作方法
1、取3m 核酸提取缓冲液于离心管中，65℃水浴预热。
2、称取水稻幼苗叶片0.5g ，剪碎，置于65℃预热的研钵中，加入少许石英砂，并加入3ml 预热到65℃的核酸提取缓冲液。快速研成匀浆，立即加入到预热离心管中，65℃恒温水浴1h ，经常轻轻摇动。
3、加入等体积氯仿-异戊醇-乙醇溶液,轻柔颠倒混匀（带手套防止损伤皮肤）后，室温静置分层10min 。
NaOH NV 58.5mg Na 100%
6ml 10mg /ml N V +?=??（）的交换率：标准氢氧化钠溶液摩尔浓度：滴定时所用的标准氢氧化钠的毫升数
4、室温下5000rpm离心5 min（弃沉淀）。
5、仔细移取上清液至另一离心管中，加入3m平衡酚，轻柔顺倒混匀，静置15 min。
6、仔细移取上清液至另一离心管中。加入1倍体积异丙醇混匀后静置20 min，出现絮状DNA沉淀。
7、4℃ 5000 rpm离心5 min。
8、将沉淀移入新的离心管中（若蛋白质和RNA未除干净可重复操作）
9、加入1.5ml氯仿与1.5ml平衡酚，轻柔顺倒混匀，室温静置15min
10、4℃离心(12000rpm,10min)
11、上清液转移到干净离心管中，加入3mL氯仿,颠倒混匀，室温静置10min
12、4℃离心(12000 rpm,10min)
13、转移上清液于新离心管当中，加入3mL氯仿,颠倒混匀，室温静置5min。
14、4℃离心(12000rpm,10m in)。
15、转移上清液于新的离心管当中→加入2μL Rnase(0.2g/L),室温放置10min。
16、加入1/10体积3mol/L NaAc和2倍体积-20℃预冷的无水乙醇。-20℃放置20min。
17、4℃离心(5000 rpm,3min)收集沉淀
18、70%乙醇洗涤沉淀,倒掉乙醇溶液,37℃干燥沉淀30min。让酒精完挥发。
19、用1mL TE溶解沉淀，此即为水稻基因组DNA溶液。
20、加RNA酶→保温20~30min。
21、取100μL水稻基因组DNA溶液，稀释10~20倍→用紫外分光光度计测定其A260、A 280及A230值，
计算DNA浓度及A260、A 280、A230的值。
22、→取５μL DNA原溶液进行1%Agrose凝胶电泳检测纯度其结果（相对分子质量大小、纯度及质量）
贴妥标签→4℃保存备用。
说明:如果蛋白质和RNA未驱除干净，重复酚，酚/氯仿，氯仿抽提步骤，继续用Rnase处理,乙醇沉淀和洗涤，重新溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。
在DNA提取过程中应做到
Ⅰ、根据不同的需要，保证结构的相对完整性；
Ⅱ、尽量排除其它大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；
Ⅲ、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。
注意事项：
1、裂解液要预热，以抑制DNase，加速蛋白质变性，促进DNA溶解。
2、各步操作要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。
3、取上清液时，不应贪多以防非核酸类成分干扰。
4、异丙醇、乙醇、NaAc要预冷以减少DNA的降解，促进DNA和蛋白质的分相及DNA的沉淀。
实验一蛋白质含量测定法
本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方
法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：
CH2COOH
|+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
NH2
2NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3)
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白
氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
五种蛋白质测定方法比较如下：
二、双缩脲法（Biuret法）
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
H2O
O=C C=O
HN NH
R-CH CH-R
O=C Cu C=O
HN NH
R-CH CH-R
H2O
紫色络合物
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁
涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
实验十三蛋白质的两性性质及等电点的测定
一、目的
通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
二、原理
蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N-端α-氨基与C-端α-羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离
为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：
调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊
度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电
点。
三、仪器和试剂
1．仪器
（1）试管架
（2）试管：15ml ×6
（3）刻度吸管：lml×4，2mI×4，10ml×2
（4）胶头吸管×2
2. 试剂
（1）1 mol／L乙酸
（2）0.1 mol／L乙酸
（3）0.01 mol／L乙酸
（4）0.2 mol／L NaOH
（5）0.2 mol／L盐酸
（6）0.01％溴甲酚兰绿指示剂
（7）0.5％酪蛋白
四、操作步骤
（1）取一支试管，加0.5％酪蛋白1ml，再加溴甲酚兰绿指示剂4滴，摇匀。
此时溶液呈蓝色，无沉淀形成。
（2）用胶头滴管慢慢加入0.2 mol／L盐酸，边加便边摇直到有大量的沉淀生成。此时溶液是pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴加0.2 mol／L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液的颜色变化。
（4）滴加0.2 mol／L NaOH进行中和，沉淀又出现。继续滴加沉淀又逐渐消失。观察此时溶液的颜色变化。
2. 酪蛋白等电点的测定
（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂
（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5％酪蛋白l ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。
五、结果处理
用一、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。
最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。
六、注意事项
缓冲液的pH值必须准确。
七、思考题
1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。
2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？
实验一醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸
一.目的
学习核糖核酸碱水解的原理和方法，掌握核糖核苷酸的醋酸纤维薄膜电泳的原理和方法。
二.原理
RNA在稀碱条件下水解，先形成中间物2＇，3＇-环状核苷酸，进一步水解得到2＇和3＇-核苷酸的混合物。
在PH3.5时，各核苷酸的第一磷酸基（PK0.7－1.0）完全解离，第二磷酸基（PK6.0）和稀醇基（PK9.5以上）不解离，而含氮环的解离程度差别很大。（见附表）因此在PH3.5条件下进行电泳可将这四种核苷酸分开。
四种核苷酸在PH3.5时的离子化程度：
本实验先用稀氢氧化钾溶液将RNA水解，再加高氯酸将水解液调至PH3.5，同时生成高氯酸钾沉淀以除去K+,然后用电泳法分离水解液中各核苷酸，并在紫外分析灯下确定RNA碱水解液的电泳图谱。
三.仪器、试剂、材料
1.仪器
电热恒温水浴锅；紫外分析灯（波长为254nm）点样器；离心机；电泳仪和电泳槽
2.试剂
100ml 0.3mol/L氢氧化钾溶液；40ml 200g/L高氯酸溶液；4g核糖核酸（粉末）；1000ml 0.02mol/L PH3.5 柠檬酸缓冲液；
3.材料
醋酸纤维薄膜（2×8cm）
四.操作方法
1.RNA的碱水解：
称取0.2g RNA，溶于5ml 0.3mol/L氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20－30mg/ml。在37度下保温18小时（或沸水浴30分钟）。然后将水解液转移到锥形瓶内，在水浴中用高氯酸溶液滴定到水解液的PH为3.5。2000转/分离心10分钟，除去沉淀，上清液即为样品液。
2.点样
将醋酸纤维薄膜在PH3.5 0.02mol/L柠檬酸缓冲液中浸湿后，用滤纸吸去多余的缓冲液。然后将膜条无光泽面向上平铺在玻璃板上，用电样器在距膜条一端2－3cm处点样。
3.电泳
将点好样的薄膜小心地放入电泳槽内，注意点样的一端应靠近负极。调节电压至160V，电流强度为0.4mA/cm,电泳25分钟。
五.结果处理
电泳后，将膜条放在滤纸上，紫外分析灯下观察，用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出。在记录本上绘出RNA水解液的醋酸纤维薄膜电泳图谱，并根据附表中的数据分析确定各斑点代表哪种核苷酸。
六.注意事项
1.点样时，在膜条无光泽面点样，且点样量要适中。
2.电泳时，膜条的点样端要靠近负极。
七.思考题
1.为什么点样要点在膜条无光泽的一端？
2. 为什么在PH
3.5时进行电泳分离核苷酸的效果最好？醋酸纤维薄膜电泳分离核苦酸
实验九酶的基本性质
一、目的
酶是生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质，生物体内的化学反应基本上都是在酶催化下进行的。通过本实验了解酶催化的高效性、特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。
二、原理
过氧化氢酶广泛分布于生物体内，能将代谢中产生的有害的H2O2分解成H2O和O2，使H2O2不致在体内大量积累。其催化效率比无机催化剂铁粉高10个数量级，反应速率可观察O2产生情况。
酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度的特异（专一）性，即一种酶只能对一种或一类化合物起催化作用。例如，淀粉酶和蔗糖酶虽然都催化糖昔键的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。还原糖产物可用本乃狄试剂鉴定。
通过比较淀粉酶在不同pH、不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素与酶活性的关系。
三、仪器、试剂和材料
1．仪器
（1）恒温水浴（37℃，70℃）、沸水浴（10℃）、冰浴（0℃）
（2）试管18 ×180共19支
（3）吸管lm l支、2ml 3支、5ml 5支
（4）量筒100ml 1个
（5）白瓷板
（6）胶头滴管3支
2．试剂
（1）Fe粉
（2）2％H2O2（用时现配）
（3）唾液淀粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再含10ml左右蒸馏水，轻轻漱动，数分钟后吐出收集在烧杯中，用数层纱布或棉花过滤，即得清彻的唾液淀粉酶原液根据酶活高低稀释50～100倍，即为唾液淀粉酶溶液。
（4）蔗糖酶溶液：取1g鲜酵母或干酵母放入研钵中，加入少量石英砂和水研磨，加50ml蒸馏水，静置片刻，过滤即得。
（5）2％蔗糖溶液：用分析纯蔗糖新鲜配制。
（6）1％淀粉溶液：1g淀粉和0.3g NaCI，用5ml蒸馏水悬浮，慢慢倒入60ml煮沸的蒸馏水中，煮沸lmin，冷却至室温，加水到100ml，冰箱贮存。
（7）0.1％淀粉溶液：0.1g淀粉，以5ml水悬浮，慢慢倒入60ml煮沸的蒸馏水中，煮沸lmin，冷却至室温，加水到100ml，冰箱贮存。
（8）本乃狄（Benedict）试剂：17.3g CuSO4·5H2O，加100ml蒸馏水加热溶解，冷却；173g柠檬酸钠和100g NaCO3·2H2O，以600ml蒸馏水加热溶解，冷却后将CuSO4溶液慢慢加到柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅匀，最后定容至1000ml。如有沉淀可过滤除去，此试剂可长期保存。
（9）碘液：3g KI溶于5ml蒸馏水中，加1g I2，溶解后再加295ml水，混匀贮存于棕色瓶中。
（10）磷酸缓冲液：
A液：0.2 mol／L Na2HPO4
称取28.40g Na2HPO4（或71.64g Na2HPO4·12H2O）溶于1000ml水中。
B液：0.lmol／L柠檬酸
称取21.01g柠檬酸（C6H8O7·H2O）溶于1000ml水中。
Ph5.0缓冲液：10.30ml A液十9.70ml B液
pH7.0缓冲液：16.47ml A液十3.53ml B液
Ph5.0缓冲液：19.45ml A液十0.55ml B液（11）1％CuSO4·5H.O溶液。
（12）1％NaCl溶液。
3．材料
每组约0.5 cm的马铃薯方块（生、熟）。
四、操作步骤
1．酶催化的高效性
取4支试管，按下表操作：
2．酶催化的专一性
取6支干净试管，按下表操作：
3．温度对酶活力的影响
取3支试管，按下表操作：
摇匀，保持各自温度继续反应，数分钟后每隔半分钟从第2号管吸取1滴反应液于白瓷板上，用碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色（只有碘液的颜色），立即取出所有试管，流水冷却5min，各加1滴碘液，混匀。观察并记录各管反应现象，解释之。
4．pH对酶活力的影响
取3支试管，按下表操作：
5．抑制剂和激活剂
五、注意事项
（1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验3、4、5应随时检查反应进行情况。如反应进行太快，应适当稀释唾液；反之，则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。
（2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量Cl－。另外，注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。
六、思考题
1．何谓酶的最适PH和最适温度？
2．说明底物浓度、酶浓度、温度和pH对酶促反应速度的影响。
3．酶作为一种生物催化剂，有那些催化特点？
2015高级生物化学及实验技术试题答案
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
八种常用生化实验步骤
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
植物生理生化实验
《植物生理生化实验》复习习题 一、名词解释： 标准曲线:用标准溶液制成的曲线。 先配制一系列不同浓度的标准溶液， 在溶液最大吸收波长下，逐一测定吸光度， 然后用坐标纸以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线。 斐林（Folin）－酚试剂法:又称lowry法，它结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是双缩脲方法的进一步发展，可利用其在650nm波长下的特定吸收进行比色测定。 茚三酮显色法: 游离氨基酸与茚三酮共热时，能定量生成紫色的二酮茚-二酮茚胺。其吸收峰在570nm，而且在一不定期范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。 氨、茚三酮与还原性茚三酮发生反应，生成紫色化合物。 该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，通过测定570nm 处的光密度，可测定氨基酸的含量。 氮素代谢:氮素及含氮的活体物质的同化、异化、排泄，总称为氮素代谢。 淀粉酶：水解淀粉和糖原的酶类总称 真空渗入: 指将叶片打孔放入注射器中，加水浸没，排出空气后用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气，轻放活塞，水液即进入组织的方法。 离心技术: 根据物质颗粒在一个实用的离心场中的行为而发展起来的 是1.分离细胞器和生物大分子物质的必备的手段之一， 也是2.测定某些纯品物质的部分性质的一种方法。 差速离心法基于待测物质颗粒大小、密度、沉降速度的不同而得到分离。 电泳:各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的颗粒, 这种带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 同工酶: 指催化同一种化学反应，但其酶本身分子结构和带电性质却有所不同的一组酶。 迁移率: 指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 溶液中带电粒子在电场中向着与它电性相反的电极移动，它的移动速度是电场和粒子的有效迁移率(m)的乘积，即：V=mE。
最新植物生理生化实验-柯玉琴-期末试卷A、B
福建农林大学考试试卷（A卷） 2006 —2007 学年第二学期 课程名称：植物生理生化实验考试时间90分钟 专业年级班学号姓名___ 一、名词解释（每小题2分，共20分） 1、标准曲线： 2、离心技术： 3、同工酶： 4、酶活力： 5、诱导酶： 6、呼吸速率： 7、种子生活力： 8、抗逆性： 9、超氧化物歧化酶（SOD）： 10、光合速率： 二、填空题（每格1分，共32分） 1、测定植物组织中可溶性蛋白质含量的方法有_______________________、________________和___________________等。 2、在测定植物可溶性蛋白质含量时，绘制标准曲线是以为横坐标，以_ 为纵坐标。 3、用茚三酮显色法测定植物组织氨基酸含量时，茚三酮溶液与氨基酸共热生成_________，
_________与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成________________。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成_________，可通过测定__________nm处的光密度，求出氨基酸的含量。 4、在测定淀粉酶的活性时：α－淀粉酶不耐，β－淀粉酶不耐。 5、测定淀粉酶活性时，3，5－二硝基水杨酸试剂（DNS）的作用是_______________________和__________________。 6、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验中，电泳存在三大效应，分别是______________、________ ____ 和。 7、测定硝酸还原酶活性的方法有___________________和_________________________。 8、类胡萝卜素吸收光谱最强吸收区在_____ ，它不仅可以吸收传递光能，还具有_______ 的作用。 9、叶绿素溶液在透射光下呈色，在反射光下呈色。 10、在研究植物矿质元素中,常用的植物溶液培养法有__ 、 __ 和 __________。 11、水培时要选用黑色容器装营养液，这是为了防止______ 。 12、常用________ 法确定植物生长的必需元素。 13、用活体法测定硝酸还原酶的材料，取样前叶子需进行一段时间的光合作用，以积累_______________，产生更多________________，加速硝酸盐的还原。 14、植物光合速率测定方法有__________________和_________________等。 三、选择题(每题1分，共10分) ） A、底物浓度必须极大于酶浓度 B、酶浓度必须极大于底物浓度， D、酶能提高反应的平衡点C、与底物浓度无关 2、蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在（）波长处。 A、260nm B、650nm C、540nm D、280nm 3、斐林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质浓度时，应选用的波长是（）。 A、260nm B、650nm C、540nm D、280nm 4、叶绿素提取时，叶片匀浆时加入少许CaCO3，其目的是（） A、使研磨更充分 B、加速叶绿素溶解 C、使叶绿素a、b分离 D、保护叶绿素 5、一般而言，正常植物叶片的叶绿素与类胡萝卜素的比值为（） A、2:1 B、3:1 C、1 :2 D、1:3
生化实验报告资料
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
生化实验基本原理及技术
生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類： (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。 核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。
第一單元 生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀 光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。 1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。 I ＝I 0 ? e -αι I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度 柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I ＝K ι log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A) 或光密度值(optical density ； OD)
生物化學實習 3 2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。 比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι 當ι（光路徑長度）＝1 cm 時 log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc 特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。 圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分 光路徑(light path)的條件下測定 波長 吸 光 值
植物生理学实验指导
植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020
植物生理学实验指导
目录
植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
生化实验设计1
实验设计：酶偶联反应测定血清中的肌酐 张燕111004048 周方111004052 周跃慧111004053 一、广泛查阅文献、确定候选方法：经过查阅相关文献，根据方法选择的要求对各种方法进行比较，充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值，再根据临床应用价值、实验室条件等综合分析后，目前主要的肌酐测定方法有化学测定法(碱性苦味酸法)、酶法、高效液相层析法、拉曼散射法、同位素稀释质谱法、毛细管电泳法及电极法等。 二、候选方法设计： 1、实验原理：肌酐经肌酐水合酶催化生成肌酸，肌酸与肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳 酸脱氢酶的级联催化作用下生成乳酸，并将NADH变成NAD+，测量在340nm处 监测NADH吸光度变化速率，其降低程度与肌酐含量呈正比例，反应式如下 P教材198 2、反应最适条件探讨：设计一系列实验分别探讨该候选方法的最适试剂浓 度、缓冲体系的种类、离子强度、pH值、反应温度和时间、检测波长等。 3、候选方法的初步试验：——对候选方法做初步评价试验，包括： ①标准曲线和重复性； ②质控血清和新鲜标本的重复试验； ③分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。 三、方法学评价： （一）重复性试验：检测候选方法的随机误差。 批内重复性试验：目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也可能由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作缺乏重现性造成，应排除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评价重复性试验应由实验者作批内(或天内)及天间重复性试验 原理：批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变)对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价酶偶联反应测定血清中的肌酐随机误差的大小。 操作步骤：将血清标本用酶偶联反应测定血清中的肌酐作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。 计算： 1．按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数()、标准差(S)和变异系数(CV%)。
生化实验整理
1.氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、实验目的 ?了解层析技术的一般原理 ?掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分 二、实验原理 层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的 固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用 流动相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂 分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比例，常用K来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据 迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用R f来表示 分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件，差异越大，分离效果越理想 层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用R f值表示： 在一定条件下，某种物质的R f值是常数。R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关 氨基酸显色反应——茚三酮反应原理： 质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质 一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质
生化实验五大技术
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
SICOLAB生化实验室建设布局
生化实验室项目新建、改建的设计规划，不单是对于仪器、设备上的选购，还要综合考虑实验室整体规划的合理性。 实验室整体建设规划在电路、供水、通风、气路、废气处理及排污、环保、安全等方面考虑。 介绍实验室基础建设一般常用项目有： (1)实验台柜包括中央实验台、实验台、边台、仪器台、天平台、药品柜、毒品柜、玻璃器皿柜等。 (2)空调通风设施。在新的化验中心，所有的建筑面积均有空调。通风系统包括通风柜(毒气柜)、排风罩(固定式)、活动式排风罩、排气扇等。 (3)用水设施包括化验盆、洗涤池、化验水龙头等。 (4)安全设施包括消防喷水灭火系统，惰性气体灭火系统，安全柜，紧急事故淋洗器、洗眼器等。 (5)供气设施包括供气站、供气板、用气板及其管路系统等。 SICOLAB生化实验室设计布局： 1、实验室内功能区设置分明，实验室内布局合理，操作安全、方便并能避免污染，能够满足工作需要，保证检验结果不受干扰。如理化实验室与理化仪器室靠近，细菌室与其所使用的仪器设备靠近，设置独立的蒸馏水室(避免所制作的蒸馏水受污染)、更衣室、储藏室(补充：储藏室用于存放少量近期不用的非过期药品。要具备防明火、防潮、防高温、防日光直射等功能。储藏室应朝北、干燥、通风良好，门窗应坚固，窗为高窗，门窗有设遮阳板。门应朝外开。)。 2、实验室所有实验台、边台、器皿柜、药品柜、通风柜由专业的实验室规划设计研究所外加工、成套制作、现场安装，符合各种技术指标的要求，更加规范，使用更安全、方便，给人感觉更加整洁、美观。 3、实验室应设立单独的给水、排水系统，避免受到污染或者污染周围环境。实验室的排气尽可能集中后向高空或者向下水道(适当处理后)排放，减少对周围环境的污染。 4、实验室的环境、使用的装修材料应符合环保和实验室的环境要求，确保不影响人体健康和实验结果。SICOLAB生化实验室之光谱分析室设计 主要是根据物质对光具有吸收、散射的物理特征及发射光的物理特性，在分析化学领域建立化学分析。主要的仪器是原子发射光谱仪、原子吸收光谱仪，分光光度计、原子荧光光谱仪、荧光分光光度计、X射线荧光仪、红外光光谱仪、电感耦合等离子体（LCP）光谱仪、拉曼光谱仪等。实验室应尽量远离化学实验室、以防止酸、碱、腐蚀性气体等对仪器的损害，远离辐射源；室内应有防尘、防震、防潮等措施。仪器台与窗、墙之间要有一定距离，便于对仪器的调试和检修。应设计局部排风。使用原子吸收罩排风较为适宜。 以上实验室，根据实际需要可设置样品处理室，一般有洗涤台、实验台、通风柜等设备，同化学实验室类似。 洁净实验室主要是通过人为的手段，应用洁净技术实现控制室内空气中尘埃、含菌浓度、温湿度与压力、以达到所要求的洁净度、温湿度和气流速度等环境参数。空气洁净度是指洁净空气环境中空气含尘量程度，空气洁净度的级别以含尘浓度划分。洁净度是指每升空气中所含粒径≥0.5um的尘粒的总颗粒。我国空气洁净等级标准分为：100级、1000级、10000级、100000级。国际标准则划分为：1级、2级、3级、4级、5级。
《生物化学》实验指导(8个实验)
生物化学实验指导 吕杰编著 新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室
内容介绍 《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目录 实验一氨基酸纸层析 (4) 实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5) 实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7) 实验四酪蛋白的制备 (8) 实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10) 实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12) 实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14) 实验八维生素C的定量测定 (16)
实验一氨基酸纸层析 一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂： （1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。 （2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； （3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升 四、实验步骤： 纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离 六、思考题： 1、何谓分配层析法和分配系数？
植物生理生化综合实验报告
大米和小麦赖氨酸、蛋白质、可溶性糖含量测定 大米和小麦是世界各国的主要粮食，更是我国各地的主食，研究分析它们的营养成分对人们日常生活的膳食有极高的指导意义。赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用；蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命增强免疫功能； 糖类是人体新陈代谢的主要能源物质，可溶性糖为植物体内最易被人体吸收的糖。本文分析了大米和小麦赖氨酸、蛋白质和可溶性糖的含量，为大米和小麦的加工和开发利用以及人们日常膳食的搭配提供了参考。 1材料和方法 供示材料为云南农业大学购买的粗米粉和粗面粉，经过一定除杂处理。 赖氨酸含量的测定采用茚三酮法：赖氨酸侧链上的游离氨酸与茚三酮反应生成紫红色络合物，颜色深浅与赖氨酸含量正相关。蛋白质含量的测定采用双缩脲法：双缩脲与蛋白质反应发生紫红色反应，颜色深浅与蛋白质含量正相关。可溶性糖含量测定采用蒽酮法。 2结果与分析 2.1面粉和米粉中的赖氨酸含量 从表1可以看出，面粉和米粉的赖氨酸含量都极低，但很明显面粉赖氨酸含量远高于米粉赖氨酸含量。 表1 面粉和米粉中的赖氨酸含量 材料赖氨酸含量（%） 面粉0.16 米粉0.0369 2.2面粉和米粉中的蛋白质含量 从表2可以很明确的看出面粉和米粉中的蛋白质含量都较高且相差不明显，约在10%——15%之间。 表2 面粉和米粉中的蛋白质含量 材料蛋白质含量（%）
2.3面粉和米粉中的可溶性糖含量 表3 面粉和米粉中的可溶性糖含量 材料可溶性糖含量（%） 面粉 3.6 米粉0.43 显然，面粉和米粉中的可溶性糖含量都不高，相较而言，面粉中的可溶性糖含量远高于米粉。 通过分析3个实验的结果可知，在面粉和米粉中蛋白质含量是极高的，可以有效的补充人体所需蛋白质，赖氨酸和可溶性糖含量相对较低。 3讨论 赖氨酸是人体必须氨基酸，缺乏赖氨酸会造成疲劳，虚弱，恶心，呕吐，头晕，没有食欲，发育迟缓，贫血等。由于大米和小麦中的赖氨酸含量甚低，需要从其他富含赖氨酸的食物中摄取，如：肉类、禽、蛋、奶，鱼、虾、贝类、乳制品和豆类、黑芝麻等。 蛋白质同样是人体必须的物质，蛋白质的缺乏常见症状是代谢率下降，对疾病抵抗力减退，易患病，远期效果是器官的损害，常见的是儿童的生长发育迟缓、体质量下降、淡漠、易激怒、贫血以及干瘦病或水肿，并因为易感染而继发疾病。2000年，中国营养学会重新修订了推荐的膳食营养素摄入量，新修订的蛋白质
生物化学实验思考题
生物化学实验思考题
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生物化学实验考试试题
细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？ 机械法：研磨，高速捣碎机;物理法:反复冻溶,超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法:自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些? 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等 ３酶法破碎细胞原理:酶分解作用 4反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用 层析技术 1.什么叫层析技术？ 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类? 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 3.指出常用层析技术的应用范围。 凝胶层析法:⑴脱盐;⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量;⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子 高效液相层析法:⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析 ４.ＳeｐhadｅxG-１0０凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么? 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。 ５．用SeｐhａdeｘG2５脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰?蛋白质 6．相对分子量为8万和1０万的蛋白质能否在SephadｅxＧ－７5柱中分开？为什么？不能,分子量差距太小。 7．将分子量分别为a(9０000）、b(45０0０）、c（１10 000)的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。ｃ、ａ、ｂ 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高?离子交换层析较高。 9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6．0，Ｈis pＩ＝7.6)，在ｐH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？Aｌa 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？ 用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则
植物生理学实验考试试题 (1)
植物生理学实验考试试题
一、名词解释： 1、标准曲线：用标准溶液制成的曲线。先配制一系列不同浓度的标准溶液, 在溶液吸收最大波长下, 逐一测定吸光度,然后用坐标纸以溶液浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标作图, 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律, 必然得到一条通过原点的直线, 即标准曲线。 4、氮素代谢：氮素及含氮的活体物质的同化异化和排泄，总称为氮素代谢。 5、淀粉酶：是水解淀粉和糖原的酶类总称。 6、真空渗入：指将叶片打孔放入注射器中，加水浸没，排出空气后用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气，轻放活塞，水液即进入组织的方法。 7、离心技术：是根据物质颗粒在一个离心场中的沉降行为而发展起来的。它是分离细胞器和生物分子大分子物质必备的手段之一，也是测定某些纯品物质的部分性质的一种方法。 8、电泳：各种生物大分子在一定pH 条件下，可以解离成带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳。 9、同工酶：凡能催化同一种化学反应但其分子结构和带电性质不同的一组酶称为同工酶 10、迁移率：指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 11、聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。 20、超氧化物歧化酶（SOD）：普遍存在动植物体内的一种清除超氧阴离子自由基Ｏ2 的酶。 21、硝酸还原还原酶：是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸。 22、诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，但在特定外来物质的诱导下诱导生成的酶。如硝酸还原酶可为NO3-所诱导生成。 二、填空： 1、测定植物可溶性蛋白质含量时，绘制标准曲线是标准蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标。 2、常用的测定植物可溶性蛋白质含量的方法有：Folin-酚试剂法(Lowry 法) 、双缩脲法、考马斯亮蓝法和紫外吸收法。 4、用滴定法测Vc 含量时，若样品本身带有颜色，则需先将样品用草酸处理。 5、测定淀粉酶活性时，3，5－二硝基水杨酸试剂（DNS）的作用是与还原糖显色生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸和终止酶活性。 6、在测定淀粉酶的活性时：α－淀粉酶不耐_酸_，β－淀粉酶不耐_热_。
生化实验技术课程 学习指南
生化实验技术课程学习指南 1．课程内容： 生命科学作为二十一世纪发展最为迅速的学科之一，生物化学技术则是其任何研究进展的技术支撑，是现代生物技术的重要组成部分。生化实验手段不仅推动了本学科的进展，而且被生物其他学科利用，促进了各学科的共同发展。生化实验技术的学习已经成为理解近代生命科学的重要基础之一。 本课程学习分基础实验与综合设计两个渐进式技能训练模块进行，其中基础实验内容主要学习生物化学的基本实验技术，包括验证与分析生化物质的6大主要类型（蛋白质、酶、DNA、糖、脂类、维生素等）和生化代谢过程的基本技术方法。内容涉及生化物质的定性、定量分析测定、电泳鉴定和代谢检测等，即课内完成8个实验项目的操作训练；同时鼓励学生自行设计实验内容，达到教学训练目标。 表1基础实验模块教学内容及技能点
综合设计实验模块内容为选取蛋白质、核酸两大类生化大分子物质提取制备和鉴定实验项目为载体，以生物化学理论为指导，设计综合贯穿生化分离检测实验的经典技术为主线的实验内容，学习生化材料预处理、沉淀技术、膜分离技术、层析技术（凝胶、离子交换、亲和析）、电泳技术、化学检测、光学检测等，以及生化产品分析鉴定的实验技术理论与操作方法。教学课时内完成2个大主题方向的实验内容，即蛋白质分离纯化鉴定、基因组提取纯化与PCR 鉴定。学生可自选各方向一个实验项目设计方案并完成操作训练，也鼓励学生选择大纲外感兴趣的实验项目，如多糖、酶等大分子物
质作为实验对象，同样设计并完成操作，达到教学要求的目标。 表2综合设计实验教学内容及技能、知识点 2．学习方法： 本课程基础实验教学采用全程参与、合作讨论、问题式、滚动式教学方法，实验教学改变书本——课堂——教师为中心的传统教学方法，建立以学生为主体、师生互动、全程参与、合作讨论式的教学形式。基础实验整个过程对学生进行强化及严格训练，每个实验项目从查阅资料、实验准备、实验操作、结果分析等整个实验活
临床生物化学实验原理、方法及检测介绍
临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术 中国中医研究院广安门医院临床检测中心 生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。 一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。 一、实验反应原理及分析方法（理论依据） 二、实验检测技术（手段）生化仪的分析技术。 三、质量控制程序（质量保证）室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。 四、临床意义（目的）咨询服务、异常结果的解释。 实验反应原理及分析方法(理论依据) 一个生物化学实验的反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性）而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。 临床化学方法的分类 特别是自动生化仪方法的特点 以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定，这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点，特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。 在一般比色法中，手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度，但由于很难控制测定时间和反应温度，很难准确记录反应过程中吸光度变化，因此，毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法，都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时，吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。 但自从自动生化仪出现后，从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术，人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率，这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间，大大提高了工作效率，还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速 度（V o ）等等。测酶初速度（V o ）只能用分光光度法。 因此，用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。 生化自动分析仪特点： 1 精确测定反应的动态过程； 2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率； 3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。 分析方法的分类