生化技术实验

电泳技术分类（按实验装置分类）
纸电泳 薄膜电泳 凝胶电泳
垂直板凝胶电泳
毛细管电泳
毛细管电泳
常用电泳技术
1、醋酸纤维薄膜电泳 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 3、SDS-PAGE 4、PAGE等电点聚焦 3、琼脂糖电泳 4、毛细管电泳
2.用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图 3.测出待测样品的迁移率 4.从标准曲线上查出样品的相对分子质量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
等电点聚焦（isoelectric focusing）
原理:
在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是 一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各 自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值 逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电 点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。
原理：
a. 待纯化分子和配体间具有亲和性
+
配体 待纯化分子
b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+
基质
c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
+
+ 杂质
基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex
应用
分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能
d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子
生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉 降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从 静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用 Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。
沉降系数（S）与分子量（M）的关系 Svederg方程: M = RTS D(1-)
生物分子的检测
1、蛋白质的测定
毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是 90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分 析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸 、 DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。
毛细管电泳装置示意图
毛细管
数据采集
光电倍 增管
光源
缓冲液-样品
高压电源
缓冲液
三、 离心技术
1．离心机类别 普通离心机 6000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 3万转/分
载体 ： 纤维素 硅藻土 硅胶
应用：各种生化物质的分离鉴定
分子筛层析（gel-filtration chromatography）
原理 基质
葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose）
应用
测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子 除去热原物质
离子交换层析（ion-change chromatography）
chromato当 的g的 极r溶 性a剂 不p作 同h流，y动被）相吸。附由剂于吸各附种的物程质度
和在流动相中的溶解度不同。层析
时，当流动相从固定相上流过时，
各组分也就不同程度地被溶解（解
吸），然后又再被吸附、再溶解再
原理：
吸附，从而以不同速度随流动相向 前移动。
载体 ： 硅胶 氧化铝 羟基磷石灰
应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷 酸 等生化物质
原理：
分配层析 分配层析实际上是一种连续抽提方式
。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以 水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。 当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中 的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均 匀地分配在两相中，各种组分按其各自的 分配系数进行不断分配，从而使物质得到 分离和纯化。
显色反 应管
光源
层析法分类及原理（按分离原理分类 ）
吸附层析 分配层析 凝胶过滤（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 聚焦层析
各类层析的原理和载体
类别
分离原理
吸附层析
化学、物理吸附
分配层析
两溶剂相中的溶解效应
凝胶层析
分子筛效应的排阻效应
离子交换层析 离子基团的交换反应
亲和层析 聚焦层析
分离物与配体之间有 特殊亲和力 等电点和离子交换作用
应用： 高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量
免疫电泳immunoelectrophoresis
微量多槽免疫电泳 火箭免疫电泳
毛细管电泳
毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（275μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端 加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过 设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳 的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。
1．层析技术一般原理 2．层析技术分类及应用
层析技术原理
层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通 常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体 上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合 物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性 、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布 在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度 移动而最终被分离。
2、酶活力的测定 3、氨基酸的测定 4、核酸的测定
凯氏定氮法（含N量 6. 25）
双缩脲法、Folin-酚法 紫外光度法（max=280nm） 离心沉降法、电泳法、层析法 终点法、动力学法 茚三酮法 Sangerf法、Edmam法、DNS法 紫外光度法（max=260nm） 分子杂交法 离心沉降法、电泳法
4320 3585 2980 1771 1166 130
54 123 141 464 1104 1072
1 2.27 2.64 8.52 20.29 19.70
回收率
（%）
100 83 69 41 27 3
第二节 几种重要的生物化学实验技术
一、层析技术 二 、电泳技术 三 、离心技术
一．层析技术（chromatography）
基质或载体
硅胶、氧化铝 、羟基磷酸 纤维素、硅藻土 、硅胶 sepharose 、sephadex 离子交换树脂 、纤维素、 葡聚糖 带配基的sepharose 或sephadex 多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）
吸附层析（ab以s吸o附r剂p作t为io固n定相，选择适
生物大分子分离纯化的一般步骤
生物组织→无细胞提取液→粗产品→
层析法 电泳法 超离心法 超滤
→结晶
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •透析
几种主要沉淀方法比较
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
+
聚焦层析（Chromatofocusing）
该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依 据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进 行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形 成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上 时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH 处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在 等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加 入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上， 其聚焦过程都能顺利完成。
生化技术实验
目录
第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几种主要的生物化学实验技术 第三节 生物分子的检测
第一节 生物大分子物质的制备
一．一般过程
二．注意事项
•材料的选择和处理 •确立测定方法 •细胞的破碎 •有效成分的抽提 •有效成分的浓缩
三．纯化方案的设计和评价
例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化
原理 基质 应用
RA（固相） + B＋ （液相） RB + A+
疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分
1.平衡阶段:离子交换剂 与反离子结合
2.吸附阶段：样品与反离
子进行交换
3、4. 解吸附阶段：用 梯度缓冲溶液洗脱，先 洗下弱吸附物质，后洗 下强吸附物质
子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：
Log M=a – b 应用: 测定蛋白质分子量
测定蛋白质亚基数
方法
1.用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与 SDS结合SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带 负电（SDS 带负电），且荷质比相同（蛋白质分 子大，结合SDS多；分子小， 结合SDS少）； 不同蛋白质分子具有相似的构象。
注意事项
1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化
纯化步骤
总蛋白
（mg）
总活力
（U）
比活力 纯化倍数
（U/mg蛋白）
1、粗酶液 2、乙醇沉淀 3、醋酸钙沉淀 4、盐析 5、丙酮沉淀 6、结晶
80 29 21 4 1 0.12
样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：
样品原点到斑点中心的距离
Rf= ——————————————
样品原点到溶剂前沿的距离
层析法分类（按装置分类 ）
纸层析 薄膜层析 柱层析
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
氨基酸分析仪图解
缓冲液泵
样品注入口 离子交换柱
记录仪
茚三酮泵
已分开的 氨基酸
光电倍 增管
2．沉降系数（S）概念
3．超离心法类别 沉降速度法（sedimentation velocity） 沉降平恒法（sedimentation eguilibrium）
超速离心机工作原理图解
转
光
轴
源
液 沉降 面 界面
沉降 物质
平 衡 池
转 头
样 品 池
光学 系统
沉降界 面峰
浓度对距离的图谱
沉降系数（S）
流速
移动速率
蛋白质1（pI=7） 蛋白质2（pI=8）
pH梯度溶液的形成示意图
层析时的聚焦效应示意图
几种主要层析方法比较
二 、 电泳技术
1．电泳的一般原理 2. 电泳技术的类别 、原理及应用
电泳的一般原理
电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极 移动的现象 。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取 决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组 分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质 、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下 ，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分 的目的。
5.再生阶段：用原始平 衡液进行充分洗涤，既 可重复使用
1
2
原始缓冲溶 液的反离子
3
4Байду номын сангаас
样品溶液
5
梯度浓度
离
子
交
换
+
原
理
及
流
程
示
意
图
阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H （强酸型），羧基-COOH（弱酸型）
阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-
亲和层析（affiuity chromatography）
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
凝胶聚合反应及催化系统 不连续PAGE 可产生的三种效应：
电荷效应、 分子筛 效应、 浓缩效应
原理：
SDS-PAGE
当SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子 即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白 质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用 下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS -蛋白质复合物在电泳 时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分