生化实验技术离心技术

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生化实验

实验一基本技术操作及吸光光度法*********************************************实验须知一、实验目的1、通过实验验证生化的基本理论，巩固所学知识。

2、掌握生物化学及分子生物学基本实验方法。

3、培养严谨、认真、实事求是的态度和正确的思维方法。

二、实验要求1、课前预习，课中认真做笔记。

2、按照实验室要求规范操作，如实记录实验结果。

3、认真，按时（当堂）完成实验报告。

三、试剂使用1、核对标签，切勿拿错试剂。

2、刻度吸管或移液器头（Tip头）与试剂必需一一对应，以免引起试剂的交叉污染。

3、用后盖好瓶盖，归还原处。

切勿张冠李戴。

四、仪器使用1、爱护仪器设备，严格遵守操作规则，注意安全。

2、精密仪器，未经允许，不得动用。

3、仪器出现故障，应立即关闭电源，报告老师。

五、实验室规则1、穿工作服进入实验室，遵守课堂纪律。

2、节约水、电、试剂，实验完毕后，清洗所用器材。

3、注意安全，若发生酸碱灼伤，应立即用大量清水冲洗。

4、值日生负责实验室卫生，倒尽垃圾，关好水电、门窗，收齐实验报告。

基本技术操作一：玻璃仪器的洗涤及干燥：（一）意义：去除干扰物，提高实验结果的准确性。

（二）常用洗涤剂：1．洗衣粉，肥皂，洗洁精，去污粉----用于一般去污。

2．强酸，强碱，尿素------去除蛋白质，核酸。

3．铬酸洗液------见附2。

4．水（自来水，蒸馏水）------用来冲洗容器。

（三）洗涤方法：* 洗涤程序：泡→洗（→泡）→冲→漱1．新仪器的洗涤：2%的盐酸浸泡数小时→自来水冲净→洗涤剂溶液中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10遍→蒸馏水漱洗内壁3遍→包装、消毒→干燥备用。

2．非定量敞口仪器的洗涤（试管、烧杯等）用后立即放入洗涤剂溶液或清水中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10遍→检查是否洗净→蒸馏水漱洗内壁3遍→包装、消毒→干燥备用。

生化大实验——精选推荐

实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。

以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。

两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。

与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。

1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。

2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。

然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。

这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。

密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。

颗粒在梯度中移动的快慢。

取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。

在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。

用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。

通过这种方法可粗略的分离叶绿体。

密度梯度离心法的原理解析

密度梯度离心法的原理解析密度梯度离心法是一种广泛应用于生物化学、分子生物学和医学领域的实验技术，用于分离和纯化生物大分子、细胞和次细胞结构。

该方法基于样品中不同组分的密度差异，利用离心力和密度梯度分离的原理来实现。

密度梯度离心法的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 密度梯度制备：制备一个由多个密度层构成的梯度液体。

这些密度层是根据密度逐渐增加或减少排列的，通常由离心管或离心管中的夹层形成。

常用的密度梯度制备物质包括蔗糖、葡萄糖或碘化物等。

2. 样品处理：将待分离的样品加入到密度梯度中。

样品可以是生物大分子如蛋白质、核酸或多肽，也可以是细胞或次细胞结构如细胞核或线粒体等。

3. 离心分离：通过高速离心设备，施加离心力将密度梯度中的样品分离。

离心过程中，样品中的各个组分受到的离心力不同，根据其密度的差异在密度梯度中上下移动。

离心力越大，移动距离越远。

4. 提取和分析：离心分离后，不同密度层中的组分被提取出来，然后进一步进行分析。

这可以是采用分光光度法、蛋白质电泳、质谱分析或核酸杂交等技术。

通过分析不同密度层中的组分，可以获取样品中各种生物大分子或细胞结构的纯度和数量信息。

密度梯度离心法的优点是可以实现高分辨率和高效率的分离和纯化。

这是因为，不同密度的组分在离心力的作用下可以根据其密度差异均匀地分布在梯度液体中，从而实现准确分离。

该方法对样品体积和细胞大小没有特别严格的要求，适用于分离和研究多种不同类型的生物样品。

密度梯度离心法还可以用于研究细胞功能和结构的多个方面。

它可以用于分离不同亚细胞器如线粒体、内质网和高尔基体等，进一步研究它们的功能和组成。

该方法还可用于分离和纯化蛋白质复合物、染色体和病毒等，为进一步研究它们的生理和生化特性提供有力的工具。

总结和回顾上述内容，密度梯度离心法是一种基于样品中不同组分密度差异的分离和纯化技术。

它可以通过制备密度梯度、施加离心力和分析不同密度层中的组分来实现。

该方法具有高分辨率、高效率和广泛适用性的优点，可用于研究多种生物样品的分离和纯化，以及细胞和亚细胞结构的功能和组成研究。

高级生物化学研究技术

生化分离方法：离心、层析、电泳和膜分离等生化分析方法：重量法、化学法、分光光度法、酶法、色谱法生化制备方法：生物大分子制备的前处理、分离纯化、浓缩与干燥、超临界流体提取法、萃取与相分离、结晶、样品的保存生化分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术等。

1 离心技术1.1 基本原理离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。

应用：各种生物样品的分离和制备。

如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。

生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。

相对离心力离心力因离心半径不同而不同，因此用“相对离心力” （relative centrifugal force，RCF）表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。

RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。

1.2 离心分类根据离心原理，按照实际工作的需要，设计了许多离心方法，大致可分三类：差速离心法(differential velocity centrifugation)速率区带离心法（rate zonal centrifugation）等密度离心法（isopycnic centrifugation）1.2.1 差速离心法利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。

操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。

差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

现代生物分离技术

现代生物分离技术生物分离技术是生物学领域中的一项重要科研技术，主要利用生物体中分子间所存在的电性、磁性、电荷、大小、形状等特性，从而通过各种不同的分离技术来获得所需的分子。

现代生物分离技术可以分为物理分离技术和化学分离技术两大类，其中物理分离技术包括了色谱分离、电泳分离、离心分离、过滤分离等各种技术，而化学分离则主要是利用化学反应或结构差异来实现生物分子的分离。

本文将对现代常用的生物分离技术进行详细说明，讨论其原理、特点及应用。

一、色谱分离技术色谱分离技术是基于质量、分子量、分子大小、溶解性、极性或疏水性等特性，将混合物中的物质从复杂的混合物中分离出来的一种分离技术。

色谱分离技术是现代分离技术中应用最广泛的一种技术，其主要原理是利用各种固定相（如气相、液相、固体等）与流动相（如气体、液体、超临界流体等）之间的相互作用来实现生物物质的分离。

主要包括了气相色谱、液相色谱、离子交换色谱、凝胶层析、亲和层析等。

色谱分离技术广泛应用于复杂的生物分子的分离和纯化，如对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离和纯化。

二、电泳分离技术电泳分离技术是利用电场作用力将荷电粒子（如DNA、蛋白质等）从混合物中分离出来的一种分离技术。

其原理是将混合物置于电场中，根据电荷的性质，荷电粒子在电场中产生运动，并在电极上沉淀。

电泳分离技术广泛应用于DNA、RNA、蛋白质等生物分子的分离和定量。

三、离心分离技术离心分离技术是根据生物分子的密度、大小、形状等物理特性将生物分子从混合物中分离出来的一种分离技术。

其主要原理是利用高速旋转的离心机作用，将混合液中的生物分子产生沉降差异，最终通过离心分离技术将生物分子分离出来。

离心分离技术广泛应用于细胞分离、蛋白质纯化、细胞器组分分离、病毒富集等方面。

四、过滤分离技术过滤分离技术是利用精密的过滤器或膜将混合物中的生物分子分离出来的一种分离技术。

其原理是利用过滤膜的孔径选择性来实现分离，对于小的分子可以通过膜的小孔径，而大分子由于尺寸过大而不能穿过膜孔。

生化分离技术与原理

生化分离技术与原理
生化分离技术是一种重要的实验室技术，被广泛应用于生物医学研究、生物制药和生物工程等领域。

其原理是通过物理或化学方法将混合的生物分子或细胞分离出来，以便进一步研究它们的结构、功能和相互作用。

生化分离技术包括很多种方法，其中最常用的有凝胶过滤、离心、层析、电泳和光学分离等。

这些方法可以根据分离原理和分离效果的不同来选择使用。

凝胶过滤是一种分子尺寸分离的方法，将混合物通过一层凝胶，分子会根据分子大小的不同而被筛选分离。

离心是利用高速旋转离心机的离心力将混合物分离开来，其中不同密度的细胞或分子可以被分离出来。

层析是利用不同材料的吸附性质或分子大小的差异来分离混合物的方法，通常用于纯化蛋白质等大分子化合物。

电泳是利用电场力将带电粒子沿电场方向移动的方法，可以根据分子大小、电荷和形状等性质来分离混合物。

光学分离是利用激光束对细胞或分子产生作用力，将混合物分离开来的方法，通常用于单细胞分离和分析。

生化分离技术的应用非常广泛，例如可以用于分离和纯化蛋白质、核酸、肽类等生物分子，还可以用于筛选药物和疫苗。

随着科技的不断发展，生化分离技术也在不断更新和改进，为生命科学研究和医学诊疗提供了更多的可能。

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生物化学实验原理与方法

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2020/11/26
生物化学实验原理与方法
二、有机溶剂沉淀法
n 原理：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。有机溶剂的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数从而增强分子之间的相互作用，使其溶解度降低。对于具有表面水层的生物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，使这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。
n 提取是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等。
n 生物分子可以分为生物大分子和生物小分子。生物小分子的结构由较强的共价键决定；生物大分子中除共价键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。因此，这两类生物分子的提取液成分和操作条件差别很大。
n 1、生物小分子的提取 n 2、生物大分子的提取
蛋白质和酶的提取核酸的提取
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生物化学实验原理与方法
溶剂提取法
n 原理:利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来 n 影响溶剂提取效率的因素（影响溶解度的的因素）
1、溶剂的性质：（根据相似相溶原理） 2、离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度对不同物质溶解度的影响不同，如高离子强度下DNA-核蛋白溶解度增加，而低离子强度下RNA-核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，在稀盐溶液中溶解度增加（盐溶）。 3、PH值：溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，不能是阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。 4、温度：温度的升高可以增加物质的溶解度。 5、去垢剂：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如SDS，Tween20，Triton X-100。

【生物化学】第八章蛋白质的分离纯化

㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配，使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显色用茚三酮显色时，得到一个滤纸层析谱。定义：原点到氨基酸停留点的距离与原点至溶剂前沿之比称为Rf值。只要把溶剂系统、温度、滤纸型号等条件确定，则每一种氨基酸的Rf值是一个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离心机主要技术指标：检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活性部位。在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相

生化实验五大技术

生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。

而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。

2.基本原理:（图1-1光吸收示意）透光度T=It/lo吸光度A=lg(lo/ I1)朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLcK 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度(mol/L)]摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为I.cm 的吸光度。

c=A/ε3. 定量分析:(1)标准曲线(工作曲线)法(2) 对比法元-KCLCxS SX X S X S X S X C A A C C C L KC L KC A A *,===即(3)计算法: e=A/ε(4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀)(5)多组分湖合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法:可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法；5.应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。

使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。

2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。

v=Q/6xrη3.影响电泳迁移率的因素:电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4:技术分类:自由电泳(无支持体)区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等5. 电泳分析常用方法及其特点:小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳⑴醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象②分离理应快，电泳时间短③样品用最少:④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球蛋白)⑵玻脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适含管状电泳------用于等电液鱼、免疫电话、血清脂蛋白等蛋白质电脉，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(3)聚丙烯肤胶凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电涉----------用于不同分子量蛋白质的电泳分离⑶SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率R的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子a的标准蛋白的对数和相对迁移所作的标准曲线中求出供试品的分子量----------最常用定性分析蛋白质的电脉方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量制定⑷等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质---------由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子相近而等电点不同的蛋白质组分。

生化实验技术理论

绪论生化实验室的基本设备1 水：常用的纯水是蒸馏水和无离子水。

消毒，常用的灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，因此实验室必须配备各种无菌处理设备。

2 酸碱度pH 测量系统。

最常用的是pH 试纸和pH 计。

液体溶质定量系统。

主要有可见分光光度计、紫外／可见分光光度计和高档的快速扫描紫外／可见分光光度计等。

常用离心机有普通台式离心机、高速冷冻离心机和超速离心机等。

电泳装置由电源和电泳槽两部分组成。

3 主要的层析技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等。

PCR (Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应，即用DNA 聚合酶在体外大量扩增DNA 片段的方法。

4生物材料的培养有微生物培养、植物细胞及组织培养、动物细胞及动物培养等。

不同的培养，其对设施的要求也有所不同。

微生物培养：需要恒温恒湿培养箱、振荡培养器即摇床（有空气和水浴式以及全温式摇床）、发酵罐、大型生物反应器等；植物细胞及组织培养：需要恒温恒湿光照培养箱、振荡培养器、生物反应器和植物房等；动物细胞及动物培养：需要二氧化碳培养箱、电热恒温培养箱和动物房等。

5 其它设备。

实验室除以上常规设备和设施外，还必须装备下列一些常用设备⑪通风柜：用于有害和有毒气体的操作。

⑫微波炉：用于化冻、灭菌及其他一些需要快速加热的操作。

⑬组织打碎机和匀浆器：用于各种生物材料、动植物组织和细胞的破碎。

第一章生物化学分离纯化策略1 三阶段纯化策略⏹纯化问题所涉及的具体步骤最终取决于样品的性质。

但也有共同可参考的阶段⏹捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。

⏹中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。

⏹精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。

2 分离方法的选择⏹蛋白质的性质---方法⏹电荷---等电点、离子交换（IEX ））⏹分子量---凝胶过滤（GF ） ⏹疏水性---疏水（HIC ）反相（RPC ） ⏹特异性结合---亲和（AC ） 3 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡（相关方法比较见下页） ⏹分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。

医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学(11)临床化学常用分析技术

医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学（11）临床化学常用分析技术一、光谱分析（分光光度技术）利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。

特点：灵敏、快速、简便。

是生物化学分析中最常用的分析技术。

分类（一）可见及紫外分光光度法分光光度法的理论基础是朗伯－比尔定律。

mber－Beer定律：A=k·b·cA为吸光度k—吸光系数b—光径，单位：cmc—溶液浓度，单位：g/L2.摩尔吸光系数：在公式“A＝k·b·c”中，当c＝1mol/L，b＝1cm时，则常数k可用ε表示。

3.比吸光系数：在公式“A＝k·b·c”中，当c为百分浓度（w/v），b为cm时，则常数k可用E%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数。

（二）原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。

即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。

常用的定量方法有：标准曲线法、标准加入法、内标法。

1.标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程分别进行测定，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线上找出对应的浓度。

由于影响因素较多，每次实验都要重新制作标准曲线。

2.标准加入法：把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。

本法的优点是能够更好地消除样品基质效应的影响，较为常用。

3.内标法：在系列标准品和未知样品中加入一定量样本中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。

以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。

生化分析与实验之离心技术

生化分析与检测
离心分离技术
化学与生命科学学院
离心分离技术

是借助离心机旋转所产生的离心力，根据物质的大小、密度、沉降系数和浮力等的不同，而使物质分离的技术过程。
一、离心技术的应用

1.用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以及对纯化的样品有关性能进行研究。 2.用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟5000转以下。

等密度离心法
1
2
3
粒子密度（ ρ p） < 最大介质密度（ρm）等密Fra bibliotek离心法的离心结果
密度屏障 I II 不连续梯度连续梯度
五. 梯度溶液的制备

(一).梯度材料的选择原则:
1、与被分离的生物材料不发生反应。 2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和pH变化较小。 3、不会对离心设备发生腐蚀作用。 4、容易纯化,价格便宜或容易回收。 5、浓度便于测定,如具有折光率。
四、离心分离方法

制备型超高速离心机的几种分离方法：
A．差速离心 B．密度梯度离心法 C. 等密度梯度离心法

A．差速离心：

利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别, 在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。
差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。
RCF＝ F离心力/F重力
＝ mω 2r/m·g=ω 2r/g ＝ 1.118 × 10-5 ×(rpm)2 × r半径

离心原理

检查合格后,将用天平平衡好的装有样品的离心管放入离心套管内，位置要对称。
盖上离心机盖子，接通电源，缓慢加速到所需速度。
用离心完毕，待转速缓慢逐步调回零位，任其自动停及稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。
注离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即
意切断电源，待检查排除故障后方能使用。
事
项
第三节常用离心方法及应用
制备离心技术
制备离心技术：是以分离纯化生化
物质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技
术。一般制备离心技术
制备超速离心技术
差速沉降离心差速区带离心密等度密梯度度区区带带离离心心
密度梯度离心法
概念：简称区带离心法，是将样品加
在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平
衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度
1617不同颗粒存在着一定的沉降速度差20s或分子量相差3倍不同颗粒存在着一定浮力密度差18不同颗粒之间存在沉降系数差时在一定离心力作用下颗粒各自以一定速度沉降在密度梯度不同区域上形成区带的方法
第五章离心技术
第一节离心技术的基本原理
离心技术：是利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。
离心机的构造
转头驱动装置速度控制系统冷却装置真空装置光学检测系统
preparative ultracentrifuge
离心转头
a 水平转头
b 角式转头
c 垂直转头
角度在14-40℃ 之间
实验中常用的是普通离心机（转速一般不高于4000rpm），用于分离血清和沉淀细胞、大的沉淀物等。
密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。

生化分离技术

生化分离技术1 生化分离技术的概述生化分离技术是指通过一系列的物理或化学分离手段将生物体内的分子分离出来。

其中最常用的方法是利用疏水作用、亲水作用、离子交换、分子筛等多种机理进行分离。

分离出来的分子种类也非常多，例如蛋白质、核酸、多糖等。

生化分离技术在生物学、医学、环保等领域得到了广泛应用。

2 离心分离离心分离是一种常用的生化分离技术，利用不同物质的密度差异将它们分离开来。

通常采用离心机来进行分离。

在离心机转速不同的条件下，不同种类的物质会在不同位置最终沉积。

离心分离可用于分离蛋白质、细胞、细胞器等。

3 凝胶过滤凝胶过滤是一种分子筛分离技术，利用凝胶和带电荷的分子筛效应将大分子分离出来。

凝胶过滤通常在实验室中用于分离蛋白质或酶，其操作简单、易于进行，但分离效果受限于凝胶孔径大小。

4 电泳分离电泳分离是利用电场力将带电离子或分子分离出来的分离技术。

通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法进行蛋白质或核酸分离。

电泳分离的速度快，分辨率高，是目前生化分离技术中最常用的一种技术。

5 亲和层析分离亲和层析分离是一种以目标分子与某种亲和基团作用为基础的分离技术。

亲和基团可以是金属离子、抗体、复合物等，在一定条件下，它们会与目标分子发生特异性结合，然后通过洗脱步骤将目标分子从载体上分离出来。

亲和层析分离广泛应用于蛋白质、DNA或RNA等分子分离。

6 总结生化分离技术是一种用于分离生物体内分子的技术，它在生物学、医学、环保、食品等领域都具有广泛的应用。

离心分离、凝胶过滤、电泳分离和亲和层析分离是常用的分离技术，它们各有特点，适用于不同类型的分子分离。

随着技术的进步，生化分离技术将会有更广泛的应用。

生化分离技术(主要内容)

生化分离技术：描述回收生物产品分离过程原理和方法的术语，是指从动植物组织培养液或微生物发酵液中分离、纯化生物产品过程中所采用的方法和手段的总称。

生化分离过程是生物技术转化为生产力不可缺少的重要环节，其技术进步程度对生物技术的发展有着举足轻重作用，为突出其在生物技术领域中的地位和作用，常称它为生物技术的下游工程。

分离纯化过程的难点：目的产物在细胞或反应液中含量不高，杂质种类多，数量大；杂质性质与产物相似；产物稳定性不高。

生化分离技术的主要种类：沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、非离子聚合物沉淀）；膜分离（透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透）；层析分离（吸附、凝胶、离子交换、疏水、反相、亲和层析）；电泳分离（SDS-PAGE、等电聚焦、双向电泳、毛细管电泳）；离心分离（低速、高速、超速离心分离技术），生化分离的特点：成分复杂；含量甚微；易变性/易被破坏；具经验性；均一性的相对性。

预处理需注意的条件：⑴温度尽可能低⑵提取液的量要保证“充分浸入”⑶加入足量酚类吸附剂⑷加入足量氧化酶抑制剂⑸搅拌转速要恰当⑹pH控制在合适范围，一般5.5～7细胞的破碎：用一定方法（机械/物理/化学/酶法）打开细胞壁或膜，使细胞内含物有效释放出来。

挤压：微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎。

沉淀：溶液中溶质由液相变成固相析出的过程。

本质：通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶解度，增加固相中的分配率。

作用：分离、澄清、浓缩、保存盐溶：低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。

盐析：中性盐浓度增至一定时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。

有机溶剂沉淀法：使溶液的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉淀；争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀。

生化分离实验报告

一、实验目的1. 理解生化分离的基本原理和方法。

2. 掌握离心、沉淀、透析等生化分离技术的操作步骤。

3. 通过实验，提高对生化分离技术的实际操作能力。

二、实验原理生化分离是利用生物大分子在物理、化学性质上的差异，将其从混合物中分离出来的过程。

常用的生化分离方法有离心、沉淀、透析、电泳、层析等。

本实验主要采用离心和沉淀法对混合蛋白质进行分离。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：兔肝匀浆液、标准蛋白质溶液、丙酮、硫酸铵、生理盐水等。

2. 仪器：离心机、试管、移液器、恒温水浴锅、烧杯等。

四、实验步骤1. 准备标准蛋白质溶液：称取标准蛋白质，用生理盐水溶解并定容至一定体积。

2. 离心分离：取一定量的兔肝匀浆液，加入适量的硫酸铵，充分混匀后静置一段时间，待蛋白质沉淀形成。

将沉淀与上清液分离，取上清液进行离心，转速为4000 r/min，时间为10分钟。

3. 沉淀分离：取离心后的上清液，加入适量的丙酮，充分混匀后静置一段时间，待蛋白质再次沉淀形成。

将沉淀与上清液分离，取沉淀进行离心，转速为4000r/min，时间为10分钟。

4. 透析分离：将离心后的沉淀溶于适量的生理盐水中，加入透析袋，放入含有适量生理盐水的烧杯中，恒温水浴加热，使蛋白质逐渐溶解。

待蛋白质溶解后，取出透析袋，将蛋白质溶液进行透析，去除小分子杂质。

5. 蛋白质鉴定：取一定量的标准蛋白质溶液和透析后的蛋白质溶液，进行比色法鉴定。

五、实验结果与分析1. 离心分离：通过离心，可以将兔肝匀浆液中的蛋白质沉淀分离出来。

2. 沉淀分离：通过沉淀，可以将离心后的蛋白质进一步纯化。

3. 透析分离：通过透析，可以去除蛋白质溶液中的小分子杂质。

4. 蛋白质鉴定：通过比色法，可以鉴定透析后的蛋白质是否为兔肝匀浆液中的蛋白质。

六、实验总结本实验通过离心、沉淀、透析等生化分离技术，成功地将兔肝匀浆液中的蛋白质分离出来，并对其进行鉴定。

实验过程中，需要注意以下几点：1. 操作要规范，避免污染。

生物化学实验技术(2)常用分离技术

二．硫酸铵的使用
硫酸铵中常含有少量的重金属离子，硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H 处理：有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H 饱和，放置过夜，溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离浓缩结晶，100℃烘干后使用烘干后使用。子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH 右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。
第三节其他沉淀法一．Fra bibliotek电点沉淀法二．生成盐复合物沉淀法三．选择性变性沉淀四．非离子多聚物沉淀法
一．等电点沉淀法
两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 值。等电点法常与盐析法、等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。合使用，以提高其沉淀能力。
使用硫酸铵时：使用硫酸铵时：
1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种，）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有 ℃或室温两种，加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或）盐析后一般放置半小时至一小时，离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。

生化分离实验总结

生化分离实验总结1. 引言生化分离实验是一种常用的实验方法，用于分离和纯化生物分子，如蛋白质、核酸等。

本文将总结生化分离实验的基本原理和常用方法，并介绍实验过程中可能遇到的问题及解决方法。

2. 基本原理生化分离实验的基本原理是利用样品中不同分子的物理性质差异，通过一系列分离步骤，将目标分子从其他组分中分离出来。

常见的生化分离方法包括离心、电泳、层析、过滤等。

•离心：利用样品中不同分子的密度差异，通过旋转离心机使分子沉淀或上漂。

•电泳：利用分子在电场中的迁移速度差异，将目标分子从复杂混合物中分离出来。

•层析：利用样品中不同分子在固相材料上的亲和力差异，通过流动相使分子在固相上进行逐步分离。

•过滤：利用膜孔大小的差异，通过过滤膜将目标分子分离出来。

3. 常用方法3.1 离心离心是一种常见的生化分离方法，适用于分离沉淀物和上清液。

实验需要使用离心机，操作步骤如下：1.将待分离的样品放入离心管中。

2.调整离心机参数，如离心速度、离心时间等。

3.开始离心，分离出沉淀物和上清液。

4.将上清液转移至新离心管中，即可得到纯净物质。

3.2 电泳电泳是一种基于分子在电场中的迁移速度差异进行分离的方法。

常见的电泳方法有蛋白质电泳、核酸电泳等。

操作步骤如下：1.准备电泳仪和电泳槽，加入凝胶和电泳缓冲液。

2.将待分离的样品与电泳缓冲液混合，加入电泳槽中。

3.设置电压和电泳时间，开始电泳。

4.根据目标分子的特性，通过观察凝胶上的条带来确定目标分子的位置。

5.切下目标条带，进行后续实验操作。

3.3 层析层析是一种利用物质在固相材料上的亲和力差异进行分离的方法。

常见的层析方法有凝胶过滤层析、离子交换层析等。

操作步骤如下：1.准备层析柱和流动相。

2.将待分离的样品与流动相混合，加入层析柱中。

3.通过缓慢加入流动相，使样品分子在柱中逐步分离。

4.收集目标分子的洗脱液，并进行后续实验操作。

3.4 过滤过滤是一种利用膜孔大小差异进行分离的方法，适用于分离固体颗粒、细胞等。

高速离心技术在生物学上应用

高速离心技术在生物学上应用高速离心技术在生物学上应用SHANG YING前言：离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。

离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。

制备性超速离心的分离方法：1. 差速沉降离心法：这是最普通的离心法。

即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。

此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。

差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。

当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。

此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2～3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。

此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。

缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。

2. 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

离心原理及沉降速度与沉降系数

离心原理及沉降速度与沉降系数离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化或澄清的方法。

尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。

离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。

离心机的种类很多，按照使用目的，可分为两类，即制备型离心机和分析型离心机。

前者主要用于分离生物材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。

这两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。

离心原理将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。

由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。

离心力和相对离心力溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个向外离心力，其定义为：F = mω2r式中：F 为离心力的强度； m 为沉降颗粒的有效质量；ω 为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s；r 为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。

很显然，离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而降低。

目前离心力通常以相对离心力Fcf 表示，即离心力F的大小相对于地球引力(G)的多少倍，单位为g，其计算公式如下：Fcf = 1.119×105(h)2r×g可以看出，在同一转速下，由于f 的不同，Fcf相差会很大，实际应用时一般取平均值。

在离心实验的报告中，Fcf、r 平均、离心时间t 和液相介质等条件都应表示出来，因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系。

显然Fcf是一个只与离心机相关的参数，而与样品并无直接的关系。