微生物检测技术作业--生物芯片

芯片实验室的操作流程
• 分子层面的单元操作主要包括进样、样品处理、混 合、反应及分离。 • 进样：利用芯片平台处理样品，需要将样品引入芯 片的样品处理通道或通道网络，该步骤通常称为进 样。进样通常又可分为上样和取样两个步骤。芯片 实验室处理的对象一般是流体。 • 混合：混合是一个物理过程，其目的是实现参与过 程的不同组分的均一分布。溶质混合有两种机理： 一种为对流传质，另一种为扩散传质。
成千上万网格状密集排列的基因探针，通过已 知碱基顺序的DNA片段．来结合碱基互补序列的单 链DNA，从而确定相应的序列，通过这种方式来识 别异常基因或其产物等。 基因芯片使合成和固定高密度的数以万计的探 针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确地检 测分析变得切实可行。
3.1 基因芯片
基因芯片按照用途可分为三类：测序芯片、表 达芯片和比较芯片（诊断芯片）。 其中，测序芯片出现的最早，研究的最多，主 要用于测序研究。
• 现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、 微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片 实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检 测和分析等部分集成的生物芯片。 • 总结：芯片实验室特点 – 高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记 及检测为一体的便携式生物分析系统。 – 实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从 而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。 – 芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。
• 反应：利用微反应器进行，微反应器利用微芯片反 应技术，其优点是可通过并行单元来实现柔性生产、 规模放大、快速和高通量筛选等。 • 分离：电泳是芯片微分离中采用最为普遍的一种形 式，芯片电泳的分离模式多种多样，如区带电泳、 胶束电动芯片电泳、介电电泳及电色谱等。以电泳 分离为主体的分离技术，在整个芯片平台技术的研 究中占有特殊的地位。
4.生物芯片的应用
4.1 基因芯片的应用
4.1.1.感染性疾病的诊断 •在生物芯片发展之前：形态学的观察及血清学的生 化分析相互配合； 缺点：耗时、花费许多人力和成本 •基因芯片：同时观察许多基因的表达，获得的基因 表达样式与数据库中的样式做比对，就可以准确地 分析出造成感染性疾病的微生物种类。
• 例：发烧芯片
例2：在未知标本中快速检测6种立克次体的方法
• 该方法针对每种立克次氏体 16S rDNA 的可变区， 分别设计和合成 4 条寡核苷酸探针，利用微阵列技 术构建立克次氏体检测用生物芯片。 • 待测立克次氏体染色体DNA用16S rDNA通用引物 扩增掺入荧光素，然后与芯片杂交，利用各种立克 次氏体的 6 条特异性探针是否全部出现杂交信号来 做出判断。 • 结果表明以寡核苷酸为探针的生物芯片系统可以实 现6种立克次氏体的检测。
例1： 4小时以内便可检测和识别病原微生物的方法 该方法的具体过程是： ①使用随机引物通过PCR法扩增细菌的核糖23S rDNA ②将扩增产物与含有特定寡核苷酸探针的芯片进行杂 交，然后通过检测系统来检测。
利用该法对158例经血培养鉴定为阳性的样品进行检测，结 果 125 份样品 (79.7 ％ ) 呈阳性，在所有未检出样品中， 9 例为芯 片上无对应探针，16例为PCR扩增无扩增产物出现，另外8例中， 有7例虽然经常规方法鉴定为金黄色葡萄球菌，但随后它们不能 进一步被证实，只有一例经分离得到金黄色葡萄球菌，被错误 地鉴定为凝固酶阴性葡萄球菌。
3.3 芯片实验室(lab-on-a-chip)
芯片实验室为高度集成化的 集样品制备、基因扩增、核 酸标记及检测为一体的便携 式生物分析系统，它最终的 目的是实现生化分析全过程 均集成在一片芯片上完成， 从而使现有的许多繁琐、费 时、不连续、不精确和难以 重复的生物分析过程自动化、 连续化和微缩化，是未来生 物芯片发展的最终目标。
3.2.3 捕获分子
捕获分子对于开发特异、敏感的蛋白芯片至关重要。
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理想的捕获分子应具有下列特点 : 对靶分子有高度的特异性和亲和力 ; 容易进行生产和操作 ; 具有可利用的大分子文库用来建立高度密集的微阵 列; • 如果困难可以实现信号放大作用。
主要的捕获分子：
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• SARS病毒抗体检测蛋白质芯片，除了可用于对临 床SARS病人的筛选和确诊，还可用于研究SARS 病毒编码蛋白质的抗原性、抗体产生特点及规律、 疾病转归的分子机理研究、疫苗的评价以及分子流 行病学的调查。
4.2 蛋白质芯片的应用
例：利用蛋白质芯片检测SARS病毒
在直径约 1 ㎝左右、镶嵌在一个个小方格中的半明 半暗小圆球组可以测出SARS病毒抗体，它就是检 测抗SARS 病毒抗体的蛋白质芯片。该蛋白质芯片 的检测系统，包含N蛋白、E蛋白、S蛋白等SARS 病毒抗原以及相应的wenku.baidu.com套对照蛋白。
• 用该蛋白质芯片对 150 例正常人和 52 例 SARS 病人 的血清进行了检测，在95％的SARS病人血清样品 内发现了针对病毒的抗体，而血清中发现了抗体说 明被测人已经感染了 SARS 病毒。 150 例正常人未 发现这一现象。 • 在对SARS病毒全基因序列分析的基础上，克隆了 10个基因，并对其中的5 个基因进行了蛋白质表达， 通过筛选发现，其中 3 个蛋白质能与 SARS 病人血 清发生特异性抗原抗体反应。
• 通过已建立的蛋白质芯片制备技术平台，用筛选的 抗原，研制出了 SARS病毒多抗体检测蛋白质芯片。 • SARS 病 毒 多 抗 体 检 测 蛋 白 质 芯 片 ， 可 同 时 对 SARS 病毒 5 种抗原的抗体进行检测，并可同时检 测IgG和IgM两类抗体，每种抗体可同时重复检测4 次。 • 以上设计不仅使诊断结果更加准确，而且使该芯片 具有取样微量、稳定性好、灵敏度高、平行检测、 结果可量化显示等特点。
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3.1.2 其他两种基因芯片
• 表达芯片：这种芯片是通过测量特定基因的mRNA 的量来推断基因的表达活性的，所以芯片的碱基序 列是特异的。杂交的结果必须同阳性对照进行比较 才能最终确定。
• 比较芯片(诊断芯片)：这种类型的芯片主要应用于 基因组的比较中。采用这种芯片可以检查基因的失 常水平。
3.2 蛋白质芯片
直接标记Direct Labeling
• 样本中所有的蛋白都用荧光或者生物素biotin进行 标记 • 优点： 对于每个靶蛋白只需要一个特异性的抗体，可检测 那些只有一个抗体的靶蛋白 • 缺点: ▷检测灵敏度的下降和数据准确性的下降 ▷标记位点可能严重改变抗原结合位点，导致抗原 抗体结合位点的破坏
2.分类
总的来说，生物芯片技术包括三大领域： • 基因芯片 • 蛋白质芯片 • 芯片实验室
3.生物芯片的工作原理
3.1 基因芯片
基本原理：将大量寡核苷酸 分子固定于支持物上，然后与 标记的样品进行杂交，通过检 测杂交信号的强弱进而判断样 品中靶分子的数量和质量。
图3-1 基因芯片
3.1 基因芯片
ELISA 方法检测抗体芯片结果：
The Enzyme-Linked Immunoab Sorbent Assay 是 经典的用于检测样品中抗原抗体结合的方法。 ELISA技术在抗原或抗体上结合了酶反应基团。加 入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进 行定性或定量分析。
• 蛋白质功能芯片是研究蛋白质间、蛋白质修饰、 DNA- 蛋白质间、 RNA- 蛋白质间、蛋白质与脂质、 蛋白质与药物、酶与底物、小分子蛋白质等相互作 用的芯片。它是将所研究体系中的每种天然蛋白质 点加在基片上制成芯片 , 用于天然蛋白质活性及分 子亲和性的高通量平行研究。
3.2.2 蛋白质芯片的工作流程
双抗体夹心法 Dual Antibody Sandwich
• 抗体点在芯片上，捕捉抗原底物后，再加入检测抗 体 ，后续加入每个抗体与点于芯片上的抗体是一 一对应关系，即对应着同一个抗原。 • 优点: ▷ 通过两个特异性抗体与抗原的结合，提高了特异 性，因而夹心法比直接标记法更灵敏 • 缺点: ▷可能导致交叉反应和抗体的沉淀
• 基本原理：蛋白质芯片, 是指以蛋白质分子作为配 基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列； 用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗 去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片 上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它 分子之间的相互作用关系。
3.2.1 蛋白质芯片的分类
按照制作方法和用途，蛋白质芯片可分为两类：
3.1.1 测序芯片的基本工作原理：
在测序芯片上，5个碱基组成的共45＝1024个 所有可能序列均通过末端附着于芯片表面上。待测 序的样品DNA和一组标记的核苷酸五聚体（标记探 针）以及连接酶一同在芯片上温育。
芯片测序流程图
芯片测序流程图
• 1024X1024=1048754 • 最终的序列可通过软 件根据探针的重叠而 读出来。
以抗体芯片为例
抗体芯片工作流程：
• 从样品中抽提蛋白质 • 用荧光染料分别标记蛋 白质 (direct labeling, paired Ab sandwich assay). • 洗涤去掉未结合的染料 • 与蛋白芯片反应 • 扫描，分析结果
两种标记方法
直接标记Direct Labeling
双抗体夹心法 Dual Antibody Sandwich
• DNA芯片与蛋白芯片最大的区别是靶分子和探针 分子的结构差异 • 相对于DNA 芯片, 蛋白质芯片技术面临更多困难。 ①蛋白质之间的相互作用的变化性更强。 ②相对于PCR 技术这样可以大量扩增DNA 的技术, 尚未有可以大量扩增蛋白质的成熟技术。 ③蛋白质的表达和纯化工作十分艰巨, 而且经常不 能保持蛋白质的完整功能。 ④许多蛋白质很不稳定。
由于这种技术通常采用玻片或硅片作为固相支 持物，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备方法， 所以称之为生物芯片技术。
• 常用的固相支持物：硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙 膜等 • 检测仪器：激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影像机等
2.分类
• 根据芯片上固定的探针不同，分为：基因芯片、蛋 白质芯片、细胞芯片和组织芯片； • 根据芯片的工作原理，分为：元件型微阵列芯片、 通道型微阵列芯片和生物传感芯片； • 根据制作过程，分为：原位合成芯片和合成点样法 制作的芯片。
发烧芯片是一块包含400个寡核苷酸的芯片， 以一群特殊设计的寡核苷酸片段为探针，29种常见 的病原菌可以在发烧芯片上显出各自特有的基因表 达式样，再与数据库建立的式样比对后，就可达到 快速鉴定感染性病原菌的目的。
4.1.2. 16S rDNA和23S rDNA作为探针来源
• 核糖体是细菌惟一的细胞器，是蛋白质合成的场所 • 编码rRNA的基因是按16S-23S-5S的顺序排列的， 并由两个非编码区分开 • 16S rDNA和23S rDNA的保守区对真细菌界的所有 细菌均具有同源性，所以要满足能够检测出所有病 原菌的需要，可以在此区选择合适的探针和引物。 • 16S rDNA在科、属、种间的变异程度不同，可以 根据需要设计细菌不同阶元的特异性引物和探针。
微生物的分子生物学检测技术—
生物芯片
1.定义
生物芯片 (biochip) 是采用光导原位合成或微量 点样等方法，将大量生物大分子，如核酸片段、多 肽分子、细胞，甚至组织切片等生物样品有序地固 化于支持物的表面，组成密集的二维分子排列，然 后与已标记的待测生物样品中的靶分子进行杂交， 通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、 高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量及 质量。
①蛋白质检测芯片 ②蛋白质功能芯片
3.2.1.1 蛋白质检测芯片
蛋白质检测芯片，是将具 有高度亲和特异性的探针 分子固定在基片上，用以 识别复杂生物样品中的目 标多肽，当放射性同位素 或荧光标记的靶分子与芯 片上的探针分子结合后， 通过检测信号的强度，从 而判断样品中靶分子的数 量。
3.2.1.2 蛋白质功能芯片